基于生信学分析乳腺癌组织PD-1、CTLA4和LAG-3表达与预后的关系

孙婷婷 方文 熊伟 王伟 邵春燕

世界卫生组织(WHO)发布的国际肿瘤登记中心的报告数据显示，全球每年新增乳腺癌病例115万，占全部女性肿瘤的23%；死亡病例41万，占全部女性肿瘤的14%[1]。目前，肿瘤学领域正在强调癌症免疫治疗在癌症治疗中的有效性。值得注意的是，免疫检查点分子，包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和淋巴激活基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)，被认为是免疫应答的关键调控因子，这推动了免疫检查点靶向治疗策略的出现[2]，他们在自身的免疫保护中起着关键作用,并维持着自身免疫耐受。在免疫微环境中,这些免疫调节分子多数已被证实[3]。PD-1主要在活化的免疫细胞上表达，包括T淋巴细胞、调节性T细胞(Treg)和自然杀伤细胞(natural killer cells，NK细胞)，从而抑制过度的免疫反应，保护正常细胞免受免疫攻击。然而，肿瘤细胞利用PD-1/程序性死亡配体1(PDL1)来逃避宿主的免疫系统。PD-1通路因其在诱导T细胞的免疫检查点反应中的作用，导致肿瘤细胞能够逃避免疫监视，对常规化疗高度不耐受，因此受到了相当大的关注[4]。有学者证明了CTLA-4的负作用[5]，他的研究表明，CTLA-4与其配体的参与，消除了TCR后T细胞分泌和TCR激活后的T细胞增殖。CTLA-4和PD-1阻滞剂可以有效的提高多种癌症类型的应答和生存率[6]。LAG-3是一个潜在的癌症免疫治疗的靶点，因为它对T淋巴细胞的负调控作用，并与PD-1联合介导一种细胞衰竭状态的能力[7]。在许多自身免疫模型中，LAG-3的不足还会导致疾病的恶化。在许多人类患者肿瘤样本中，LAG-3与PD-1的共表达与T淋巴细胞功能障碍状态相关[8]。本次研究评估分析乳腺癌中免疫检查点分子的表达水平、免疫细胞浸润水平以及我们还研究了这些免疫检查点分子的预后意义，为乳腺癌治疗和预后找到一个新方向。

1 资料与方法

1.1 利用TIMER 2.0数据分析PD-1、CTLA4和LAG-3在不同肿瘤类型中的表达差异 通过TIMER 2.0网站(http://timer.comp-genomics.org)[9]数据库类型分别选择“PD-1、CTLA4和LAG-3”“显示在不同癌症组织中的差异表达。

1.2 利用UALCAN数据分析PD-1、CTLA4和LAG-3在不同类型乳腺癌组织中的表达 使用UALCAN网站(http://ualcan.path.uab.edu/)[10]首页，数据库类型选择“breast invasive carcinoma”分别输入基因名称“PD-1、CTLA4和LAG-3”，分析不同类型乳腺癌组织中PD-1、CTLA4和LAG-3基因表达的变化。

1.3 利用TIMER 2.0数据分析平台对PD-1、CTLA4和LAG-3在乳腺癌组织中浸润T细胞的表达分析 使用TIMER 2.0网站(http://timer.comp-genomics.org)首页，对PD-1、CTLA4和LAG-3对来自TCGA数据中乳腺癌组织中浸润T细胞的表达分析。

1.4 生存分析 使用PrognoScan数据库(http://www.prognoscan.org/)[11]比较乳腺癌组织中PD-1、CTLA4和LAG-3高表达与低表达样本的生存曲线。

2 结果

2.1 PD-1、CTLA4和LAG-3基因在乳腺癌组织中的表达及在不同分型乳腺癌中的表达 UALCAN数据库分析结果显示，乳腺癌组织中的PD-1、CTLA4和LAG-3的表达量均高于正常组织(P<0.01)，同时，我们发现在不同分型的乳腺癌中，PD-1、CTLA4和LAG-3的表达量在三阴乳腺癌中表达量均高于其他类型的乳腺癌。见表1～6。

表1 TCGA数据库中PD-1在正常对照组和乳腺癌组中的表达比较

表2 PD-1在乳腺癌分子分型亚组中的表达比较

表3 CTLA4在正常对照组和乳腺癌组中的表达比较

表4 CTLA4在乳腺癌分子分型亚组中的表达比较

表5 LAG3在正常对照组和乳腺癌组中的表达比较

表6 LAG3在乳腺癌分子分型亚组中的表达比较

2.2 免疫检查点分子PD-1、CTLA4和LAG-3在不同肿瘤类型组织中的表达 由于3个免疫检查点分子PD-1(PDCD1)、CTLA4和LAG-3与T淋巴细胞的衰竭和免疫逃逸相关，因此我们使用TIMER2.0从TCGA数据库来研究这些分子在肿瘤和正常组织中的mRNA水平。本研究从 TCGA 数据库中评估 PD-1、CTLA4和LAG-3基因在32种肿瘤类型中1 087个样本中的表达水平，通过数据库分析结果显示，PD-1在脑和中枢神经系统(CNS)癌症、乳腺癌和宫颈癌中的表达相对较高，而CTLA4在许多癌症中的表达水平较高，包括乳腺癌和肺癌。LAG-3在膀胱癌、脑癌和中枢神经系统癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病中的表达相对较高。PD-1、CTLA4和LAG-3在不同癌症组织与癌旁组织的表达存在差异。

图1 PD-1、CTLA4和LAG-3免疫浸润水平

2.4 乳腺癌中PD-1、CTLA4和LAG-3高表达样本与低表达样本的Kapln-Meier生存曲线 PD-1高表达的患者生存时间明显低于低表达的患者(Hr=2.94,P=0.002);CTLA4高表达的患者生存时间明显低于低表达的患者,差异有统计学意义(Hr=0.89,P=0.011);LAG-3高表达的患者生存时间明显高于低表达的患者,差异有统计学意义(Hr=0.33,P=0.003)。见图2。

图2 PD1、CTLA4和LAG3在乳腺癌组织中和癌旁组织中高表达和低表达样本的生存曲线

3 讨论

乳腺癌是一种可以产生免疫应答肿瘤疾病[12]。在乳腺癌中，肿瘤的发展过程与肿瘤免疫微环境的变化有一定关系，说明免疫治疗也可能应用于乳腺癌的治疗并取得一定疗效。

PD-1被认为参加了T细胞衰竭，并负向调节免疫反应。PD-1表达于T细胞表面，不同类型肿瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞中均有PD-1的高表达，Mizuno等[13]研究报道，乳腺癌组织PD-1、PD-L1阳性表达均高于癌旁正常组织,这与其的相关研究相符。在正常情况下，PD-1与其配体结合后，能够通过抑制自身的免疫应答，预防发生自身免疫性疾病[14]。但许多研究发现在许多肿瘤细胞中PD-L1表达升高，可通过与淋巴细胞表面的PD-1相互作用，削弱机体对肿瘤细胞的免疫应答，促进肿瘤细胞免疫逃逸，继而导致肿瘤的发生、发展[15]。本研究中通过TCGA数据中的数据分析，图1所示，PD-1在乳腺癌中的表达显著差异(P<0.01)，同时，在三阴乳腺癌中，PD-1的表达显著高于其他分型的乳腺癌，K-M生存分析表示高表达PD-1的患者生存率明显低于低表达患者，差异有统计学意义(P<0.01)。

CTLA-4主要通过与CD28受体竞争结合抗原提呈细胞(APCs)上的B7配体(B7-1/CD80和B7-2/CD86)。在T淋巴细胞的激活过程中，T淋巴细胞上的CD28受体与APCs上的B7配体结合，为T淋巴细胞提供第二激活信号。CTLA-4受体以较高的亲和力与B7配体结合，因此，在CTLA4受体的存在下，缺乏第二种激活信号会导致T淋巴细胞的能量不足[16-18]。目前，阻断 CTLA4与其配体结合能够解 除 T细胞活性 受抑制状态，重新激活 T细胞 的免疫 反应从而引起抗肿瘤效应。目前主要的CTLA-4抑制剂有 Ipilimumab、Tremelimumah等[19]。已经开始应用在治疗乳腺癌的免疫治疗中。通过本次的数据库分析，CTLA-4在乳腺癌中表达差异有统计学意义(P<0.01)，同时在不同分型的乳腺癌中，也存在着不同的表达差异。K-M生存分析表示高表达CTLA-4的患者生存率明显低于低表达患者(P<0.05)。目前很多研究表明，PD-1和CTLA-4的阻滞剂能提高癌症患者的应答率和中位生存时间，但也增加了不良事件的发生率，可能需要进一步的研究来减少不良事件的发生率和强度[20]。

抑制性免疫检查点LAG-3抑制T细胞活化和细胞因子分泌，从而确保免疫稳态。它对不同类型的淋巴细胞具有不同的抑制作用，与PD-1具有显著的协同作用[21]。LAG-3是一个潜在的癌症免疫治疗靶点，因为它对T细胞的负调控作用及其与PD-1联合介导细胞的衰竭[22]。LAG-3可能介导双向信号进入相互作用的APC。MHCII类与表达LAG-3的Treg的结合已经被证明可以抑制树突细胞的激活，从而抑制它们的成熟[23]。通过数据库分析，在乳腺癌中LAG-3的表达存在显著差异(P<0.05)，同时在三阴乳腺癌中高度表达差异是值得被关注的，通过生存分析，在高水平表达LAG-3的乳腺癌患者中生存率明显低于LAG-3低表达的患者。

综上所述，本研究通过运用多种生物信息学的分析方法，对免疫检查点PD-1、CTLA4和LAG-3在乳腺癌组织中的表达和免疫浸润水平分析以及生存时间进行了综合分析，我们认为在不同类型的乳癌症组织中，免疫检查点PD-1、CTLA4和LAG-3的表达水平不同，但在乳腺癌组织中的表达是具有显著差异的，并影响乳腺癌患者的生存时间，说明这与疾病的预后是紧密相关的，PD-1、CTLA4和LAG-3可能会成为乳腺癌潜在的预后因子和治疗靶点。同时在对免疫浸润水平分析时发现，PD-1、CTLA4和LAG-3在不同的免疫细胞表达有显著差异，这可能作为乳腺癌免疫治疗新的研究方向。此外，本研究通过阐明免疫检查点与疾病作用的关系，这将可能成为乳腺癌新的诊疗和预后评估方向。