miR-452-5p调控YTHDF2肝细胞癌细胞凋亡和铁死亡的机制研究

王雪梅

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要类型(>85%)，其病死率位居世界第二，近几年肝细胞癌的新发病例数和死亡数逐年增长，尤其在中国[1]。对于肝细胞癌早期的患者进行肝脏切除、肝移植或局部消融有助于患者的预后，而晚期或肝硬化患者的预后很差[2]。微小RNA(miRNA)是一种短链非编码的内源保守的18～22个核苷酸之间的RNA片段，通过调控靶基因的转录、翻译而抑制蛋白的表达，以此参与人类几乎所有疾病的发展[3]。miR-452-5p为众多新发现的miRNA之一[4]。m6A作为真核细胞mRNA上最常见的内部修饰之一，对基因的表达十分重要[5]。YTH结构域家族2(YTH domain family ,member 2，YTHDF2)是最有效的m6A结合蛋白，可通过结合含有m6A的结合位点的基因以削弱其稳定性[6]。最新报道显示，YTHDF2能够降解肿瘤启动子并抑制癌基因的mRNA表达[7]。铁死亡是近年提出的一种调节性细胞死亡方式，主要依赖于细胞内铁和脂质活性氧(reactive oxygen species，ROS)积累所引起的细胞死亡[8]。本研究旨在探索miR-452-5p、YTHDF2调节肝细胞癌细胞凋亡、铁死亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B细胞购自美国菌种保藏中心；活性氧检测试剂盒(DCFH-DA荧光探针法)购自北京百奥莱博公司；细胞计数试剂盒(cell counting Kit，CCK8)购自日本同仁；实时荧光定量聚合酶链式反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天；细胞免疫荧光法检测细胞中ROS含量；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega；所有miR-con、miR-452-5p mimics、anti-miR-con、anti-miR-452-5p及引物的设计合成均委托上海吉玛公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B细胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃恒温细胞培养箱中培养。培养箱中含有5%CO2、95%O2的饱和湿度气体环境中。每2 天更换1次培养液。

1.2.2 细胞转染与分组：将正常培养至对数生长的细胞设为L02组、SMMC-7721组、HepG2组、Huh7组、Hep3B组。将不做任何处理的HepG2细胞设为NC组；使用脂质体LipofectamineTM3000将anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、anti-miR-452-5p组(转染anti-miR-452-5p)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-YTHDF2组(转染pcDNA-YTHDF2)、anti-miR-452-5p+si-con组(共转染anti-miR-452-5p 和si-con)、anti-miR-452-5p+si-YTHDF2组(共转染anti-miR-452-5p 和si-YTHDF2)转染HepG2细胞12 h，继续培养48 h，RT-qPCR或WB实验检测转染是否成功。确认成功后用于后续研究，否则继续更换转染条件至成功。

1.2.3 RT-qPCR实验：收集需要检测的细胞，Trizol液提取总RNA，反转录试剂盒将其合成cDNA，-20℃保存，作为模板备用。用RT-qPCR试剂盒检测模板中miR-452-5p、YTHDF2的表达。以U6、GAPDH为内参，2-△△Ct法计算miR-452-5p、YTHDF2的表达水平。扩增程序设置为：94℃，2 min；94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s，进行45个循环，72℃，保存5 min。引物信息：miR-452-5p，上游引物5’-AAGAGGGCATGGAAACACTG-3’，下游引物5’-ACTCACCCCATTCTTCAAGG-3’；YTHDF2，上游引物 5’-GCTTGCCTGCTACATAGTGAGA-3’，下游引物5’-AACTGAACTGCTTAACCTTCTGG-3’。U6、GAPDH所用为通用引物。

1.2.4 ROS含量检测：收集细胞，PBS充分洗涤。按照活性氧检测试剂盒(DCFH-DA荧光探针法)的说明书要求逐步操作，加入DCFH-DA，避光孵育30 min，用酶标仪在480 nm激发波长/530 nm发射波长处检测荧光强度，荧光显微镜下拍照细胞的荧光图。

1.2.5 WB实验：细胞中加入足够量的RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取总蛋白。然后对蛋白定量、变性，SDS-PAGE蛋白电泳。用转膜仪将蛋白转移到NC膜，再用含2.5%脱脂奶粉的封闭液对膜37℃封闭处理2 h。将膜浸泡再稀释过的一抗稀释液中，4℃孵育过夜，充分洗膜。再浸泡在稀释的二抗溶液中37℃孵育2 h，充分洗膜。最后，用ECL发光液显影曝光。

1.2.6 CCK8实验：收集待检细胞，用培养液调至5×104个/ml，取200 μl置于96孔板，再加入10 μl的CCK8反应液，避光孵育20 min。在490 nm波长下检测细胞的吸光度。细胞活性(%)=OD490实验组/OD490对照组×100。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI凋亡检测实验：收集待检测的细胞，充分洗涤5次，再用500 μl结合缓冲液悬浮细胞。依次加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI避光反应10 min，上流式细胞仪分析细胞的凋亡。总凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.8 双荧光素酶报告基因检测实验：生物信息学靶点预测网站Starbase(https://starbase.sysu)预测miR-452-5p的靶位点，发现YTHDF2的3’UTR与miR-452-5p存在连续的结合位点。化学合成YTHDF2-WT(含YTHDF2 3’UTR)和YTHDF2-MUT(不含YTHDF2 3’UTR)，并将其插入荧光载体，构建荧光报告基因载体。YTHDF2-WT和YTHDF2-MUT报告载体分别与miR-con、miR-452-5p、anti-miR-con、anti-miR-452-5p共转染基因检测试剂盒检测细胞的荧光活性。

2 结果

2.1 肝细胞癌细胞中miR-452-5p和YTHDF2的表达 与L02组比较，SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B组miR-452-5p表达升高(P<0.05)，YTHDF2 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 YTHDF2蛋白电泳图

表1 miR-452-5p和YTHDF2在L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7和Hep3B细胞中的表达

2.2 抑制miR-452-5p调节HepG2细胞增殖 与anti-miR-con组比较，anti-miR-452-5p组HepG2细胞miR-452-5p表达和细胞活性均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 抑制miR-452-5p的HepG2细胞增殖

2.3 抑制miR-452-5p对HepG2细胞的凋亡、铁死亡的调控 与anti-miR-con组比较，anti-miR-452-5p组HepG2细胞凋亡率、ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表达均显著升高(P<0.05)。见图2，表3。

图2 抑制miR-452-5p的HepG2细胞的凋亡、铁死亡相关蛋白的表达；A HepG2细胞ROS含量；B HepG2细胞凋亡图；C HepG2细胞SLC7A11、GPX4和FTH1蛋白表达

表3 抑制miR-452-5p诱导HepG2细胞凋亡、铁死亡

2.4 miR-452-5p靶向调控YTHDF2的表达 miR-452-5p组YTHDF2-WT细胞的荧光活性显著低于miR-con组；与miR-con组相比，miR-452-5p组YTHDF2蛋白表达显著降低，与anti-miR-con组相比，anti-miR-452-5p组YTHDF2蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图3,表4。

图3 miR-452-5p靶向调控YTHDF2;A miR-452-5p与YTHDF2的靶向序列；B HepG2细胞中YTHDF2蛋白表达

表4 双荧光素酶报告实验结果及miR-452-5p调控YTHDF2的表达

2.5 过表达YTHDF2调控HepG2细胞凋亡、铁死亡 与pcDNA组比较，pcDNA-YTHDF2组HepG2细胞中YTHDF2蛋白表达显著升高，细胞凋亡率显著升高，ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表达均显著升高(P<0.05)。见图4，表5。

图4 过表达YTHDF2对HepG2细胞凋亡、铁死亡的影响；A HepG2细胞ROS的含量；B HepG2细胞的凋亡图；C HepG2细胞中YTHDF2、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表达

表5 过表达YTHDF2抑制HepG2细胞凋亡、铁死亡

2.6 敲减YTHDF2部分逆转anti-miR-452-5p对HepG2细胞凋亡、铁死亡的作用 与anti-miR-452-5p+si-con组比较，anti-miR-452-5p+si-YTHDF2组HepG2细胞YTHDF2蛋白表达显著降低，细胞凋亡率降低，ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见表6，图5。

表6 敲减YTHDF2的anti-miR-452-5p处理HepG2细胞凋亡、铁死亡情况

图5 敲减YTHDF2对anti-miR-452-5p调控HepG2细胞凋亡、铁死亡的影响;A ROS含量的荧光图；B HepG2细胞凋亡图；C HepG2细胞YTHDF2、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表达

3 讨论

miR-452-3p/5p参与人类多种癌症的进展，如胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等[9,10]。虽有大量证据显示miRNA参与癌症的恶化进程的调控，但是其调控的机制十分复杂，至今仍在探索之中。Tang等[4]报道，miR-452-3p在肝癌样本中的表达异常升高，并且过度表达miR-452-3p促进癌细胞的增殖、迁移，抑制凋亡，这与miR-452-3p直接靶向抑制CPEB3/EGFR信号通路的活性存在联系。Yang等[11]在肝癌的研究中报道，circ-ABCB10在体内和体外均抑制肝癌的恶性进展，其机制与抑制miR-340-5p/miR-452-5p-NRP1/ABL2信号通路的活性相关，为肝癌的靶向治疗提供新靶点。Zheng等[12]最新研究报道，miR-452-5p在肝癌中的表达显著升高，并作为癌基因参与肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制为靶向COLEC10。这些研究说明miR-452-5p参与肝癌的恶化过程且作用机制多种多样，但是其是否与肝癌细胞的铁死亡存在联系尚未可知。本研究检测了正常肝细胞和肝细胞癌细胞中miR-452-5p的表达，结果与前人的研究结果相一致，即miR-452-5p在肝细胞癌细胞中高表达。抑制miR-452-5p抑制肝细胞癌细胞增殖，促进凋亡和铁死亡以及铁死亡相关基因ROS、SLC7A11、GPX4和FTH1的表达，这与前人关于miR-452-5p的研究结果[11,12]相吻合。进一步研究通过双荧光素酶报告基因检测实验验证了miR-452-5p靶向YTHDF2，也许YTHDF2可能与miR-452-5p调控肝细胞癌细胞凋亡和铁死亡存在联系。

m6A作为真核生物中最普遍的mRNA修饰之一，其在许多生物学过程中发挥作用，如mRNA稳定性、蛋白质翻译、病毒感染和胚胎发育[13,14]。YTHDF2(YTH结构域家族成员2)是功能性m6A结合蛋白的明星基因，其主要调节mRNA的稳定性。YTDF2通过其C-末端YTH(YT521 B同源)结构域识别并结合mRNA 3’UTR位点，加速靶基因的降解[15]。据报道，YTHDF2在胰腺癌细胞中具有促进增殖和抑制迁移和侵入的双重作用[16]。Hou等[17]发现，YTHDF2在肝癌组织中的表达显著降低，这是由缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)介导的，HIF-2α抑制剂或过表达YTHDF2可恢复YTHDF2的表达并抑制肝癌细胞的增殖和裸鼠体内肿瘤的生长，其机制与YTHDF2直接结合EGFR的 3’-UTR有关。但Shao等[18]报道，YTHDF2在肝细胞癌中高表达，与患者的不良预后、癌细胞浸润紧密相关。本研究发现，YTHDF2在肝癌细胞中的表达显著降低，与Hou等[17]的研究结果相一致，与Shao等[18]的研究结果相悖。过表达YTHDF2明显促进HepG2细胞凋亡、铁死亡，并且敲减YTHDF2还可部分逆转抑制miR-452-5p对HepG2细胞凋亡、铁死亡的促进作用。

综上所述，抑制miR-452-5p促进肝细胞癌细胞凋亡、铁死亡，产生这种作用的机制与直接靶向YTHDF2有关，为肝细胞癌的精准治疗提供新靶点。