BST1基因rs4698412多态性与新疆地区帕金森病临床特征的相关性研究

宋秋霞，张晓莺，刘燕，郭淼，王琳琳，王琳

帕金森病(PD)是一种严重影响中老年人生活质量和健康的神经功能障碍性疾病。PD致病基因通过不同的作用途径参与PD的发病，致使PD患者存在不同的临床表现，PD患者携带基因多态性位点不同其临床表现可能存在差异[1-6]。BST1基因位于染色体4p15，自2009年被发现是PD的致病风险基因[7]，此后关于BST1基因与PD发病风险相关性[8-20]、导致PD发生机制的诸多研究[21-23]陆续被阐述。目前有多项研究[8-20]针对国内外不同地区、不同人群BST1基因多态性与PD相关性的研究，有部分研究[13,17]分析了其不同基因型间PD患者临床症状的差异性，国内目前的研究[13-14,16-17]主要针对湖南、湖北、江西、重庆、江苏地区人群，尚无针对新疆地区人群的相关研究。目前公认PD为环境-遗传共同作用所致疾病，新疆地区具有独特的民族多样性，居民的居住环境、生活习惯与我国其他地区存在一定差异。本课题组前期已经完成了新疆地区PD患者临床症状与SEPT14基因多态性、COMT基因多态性、SNCA基因多态性的关系研究[4-6]，现将分析BST1基因rs4698412位点多态性与新疆地区PD的相关性、对PD患者临床症状的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 (1)PD组：选取2017年2月至2019年5月在新疆喀什地区农三师51团和53团、阿克苏4团、芳草湖农场、独山子地区流行病学调查过程中及新疆生产建设兵团医院确诊的PD患者，共192例。全部病例均符合英国脑库的诊断标准。排除标准：①特发性震颤;②继发性帕金森叠加综合征;③严重痴呆、构音障碍影响情感表达;④同时患有其他精神疾患。(2)对照组：系同一时期收集的非脑部器质性疾病，无锥体外系疾病史，无神经系统变性病、精神疾患及家族史，在性别、年龄、文化上与PD组匹配的健康人群，共199名。两组性别、年龄差异均无统计学意义。该项研究的所有受检者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 研究资料收集 采用统一的调查表(参考西安交通大学第一附属医院神经内科的PD危险因素调查表结合新疆地区实际情况制定)，由神经内科研究生和副主任医师各一名对研究对象进行面对面调查。内容包括：(1)一般资料(PD组和对照组)：姓名、性别、年龄、民族、出生年月、职业、文化水平、受教育年限、家庭情况等。(2)临床资料(PD组)：①专科评估：既往病史、有毒物质接触史、家族史、现病史、起病时间、确诊时间、确诊医院、是否单侧起病、首发症状(震颤、肌张力增高、运动迟缓、姿势反射异常、其他)、首发部位(单上肢、单下肢、双上肢、双下肢、躯干、头部、下颌)、病情进展顺序和间隔时间、是否“N”字型进展、开-关现象、异动现象、用药情况及相关疗效和不良反应、全面系统的内科检查结果。②相关量表评估：严格按照PD相关评分定义标准在患者“关期”完成统一帕金森病评定量表(UPDRS)量表(Ⅱ-日常生活活动部分、Ⅲ-运动检查部分、Ⅳ-治疗并发症部分)、Hoehn-Yahr(H-Y)分级、MMSE、日常生活能力问卷(ADL)量表的评分。(3)是否合并痴呆。根据文化程度、MMSE评分来评定。痴呆标准：文盲组MMSE≤17分、小学组MMSE≤20分、中学及以上MMSE≤24分。(4)不同抗PD药物的使用剂量。使用左旋多巴等效剂量作为指标。左旋多巴等效剂量换算方法：100 mg左旋多巴(125 mg左旋多巴-苄丝肼)=1 mg普拉克索=100 mg金刚烷胺=100 mg吡贝地尔=133 mg卡比多巴-左旋多巴=5 mg罗匹尼罗=10 mg司来吉兰;联用儿茶酚-0-甲基转移酶抑制剂恩他卡朋可按左旋多巴剂量的1.33倍计算总量，即0.5 mg普拉克索=62.5 mg左旋多巴-苄丝肼，100 mg金刚烷胺=125 mg左旋多巴-苄丝肼，50 mg吡贝地尔=62.5 mg左旋多巴-苄丝肼; 200 mg卡比多巴-左旋多巴=187.5 mg左旋多巴-苄丝肼。

1.2.2BST1基因多态性测定

1.2.2.1 DNA提取 取受检者外周静脉血2 ml, EDTA抗凝，-40 ℃保存。用北京君诺德科技公司血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA,-80 ℃保存。

1.2.2.2BST1基因rs4698412位点竞争性等位基因特异性PCR(KASP)技术分型 见表1。从公共数据库NCBI GeneBank数据库查询基因BST1标准序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，位点序列号为rs4698412。采用Primer Premier 3.0软件设计SNP rs4698412位点的KASP引物(http://primer3.ut.ee/)。用 2×EasyTaq PCR SuperMix(购自全式金)试剂盒进行PCR，获得的PCR产物用KASP Master Mix V3.0(购自LGC公司)进行延伸反应。延伸产物纯化后在ABl3730xl测序仪进行测序。SNP的分型采用GeneMapper 4.1(Applied biosystems)进行序列比对分析。

表1 KASP分型引物位点引物名称引物序列rs4698412Primer_Allele FAMGAA GGT GAC CAA GTT CAT GCT CAT CGG AGC CCC AGC CAA GGG GCGPrimer_Allele HEXGAA GGT GAC CAA GTT CAT GCT CAT CGG AGC CCC AGC CAA GGG GCA

1.2.3 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。两组间计量资料比较采用t检验或方差分析，计数资料比较采用χ2检验或者非参数检验，以P<0.05为统计学差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PD组和对照组一般资料汇总 PD组共192例，包括男性101例，女性91例，平均年龄(67.51±10.25)岁。对照组共199例，包括男性87例，女性112例，平均年龄(67.35±9.76)岁。PD组和对照组间性别、年龄分布差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.2 PD患者临床资料一览表 见表2。汇总分析了192例PD患者的专科临床资料(发病年龄、病程、是否单侧起病、首发部位、首发症状、是否“N”字型进展、是否存在开-关现象、是否合并痴呆、服用药物情况-左旋多巴等效剂量)和专科量表资料(UPDRS-Ⅱ评分、UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、H-Y分级、ADL评分、MMSE评分)情况。

表2 PD患者专科资料汇总(x±s,例) 专科资料发病年龄(岁)61.43±10.99合并痴呆(是/否)67/125病程(年)6.09±4.77左旋多巴等效剂量(mg)535.01±176.07单侧起病(是/否)164/28UPDRS-Ⅱ评分(分)17.20±10.36首发部位(上肢/下肢/混合+其他)130/54/8UPDRS-Ⅲ评分(分)34.97±20.72首发症状(震颤/强直-运动迟缓/混合+其他)82/34/76UPDRS-Ⅳ评分(分)2.56±4.79“N”字型进展(是/否)82/110H-Y分级2.56±0.93开-关现象(是/否)31/161ADL评分(分)44.42±22.33异动现象(是/否)34/158MMSE评分(分)24.22±5.04

2.3 PD组、对照组BST1基因rs4698412位点KASP技术分型及测序结果 PCR反应程序结束后将样本置于ABI Q6中检测 FAM及HEX荧光信号，收集荧光信号，仪器根据每个样本检测的荧光信号值自动分型，Homozygous为纯合子，Heterozygous为杂合子。主要检出G/G纯合子、A/G杂合子和A/A纯合子。KASP分型见图1，测序峰图分析见图2～图4。

图1 rs4698412 位点KASP分型图

图2 rs4698412基因型A/A测序峰图

图3 rs4698412基因型G/G测序峰图

图4 rs4698412基因型A/G测序峰图

2.4 rs4698412位点基因型在PD组和对照组的分布特点比较 见表3。rs4698412位点三种基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，病例组、对照组基因型分布均吻合度良好。三种基因型频率分布在PD组和对照组间无统计学意义(P>0.05), 两种等位基因频率分布在PD组和对照组间无统计学意义(P>0.05)。

表3 rs4698412位点基因型和等位基因在PD组与对照组中的分布特点比较[例(%)]组别基因型A/AG/GA/GP值等位基因AGP值PD组34(17.7)79(41.1)79(41.1)0.765 147(38.3)237(61.7)0.963对照组32(16.1)78(39.2)89(44.7)153(38.4)245(61.6)

2.5 不同BST1基因型PD患者临床特点分析

2.5.1 总体样本中不同BST1基因型间PD患者专科临床特点比较 见表4。 rs4698412位点三种基因型间:PD患者合并痴呆的发生率差异有统计学意义(P=0.011)，PD患者中A/G基因型携带者合并痴呆的发生率低于A/A基因型和G/G基因型携带者;发病年龄、病程、是否单侧起病、首发部位、首发症状、左旋多巴等效剂量、UPDRS-Ⅱ评分、UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、H-Y分级、MMSE、ADL差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表4 总体样本rs4698412位点不同基因型对PD患者临床症状影响分析[x±s,例(%)]临床症状A/AG/GA/GP值发病年龄(岁) 63.65±9.6261.19±10.8660.71±11.680.581病程(年) 6.62±6.156.30±4.685.66±4.190.687单侧起病是28(82.4)67(84.8)69(87.3)0.773否6(17.6)12(15.2)10(12.7)首发部位上肢26(76.5)53(67.1)51(64.6)0.797下肢7(20.6)23(29.1)24(30.4)混合+其他1(2.90)3(3.80)4(5.10)首发症状震颤14(41.2)36(45.6)32(40.5)0.362强直-运动迟缓3(8.80)17(21.5)14(17.7)混合+其他17(50.0)26(32.9)33(41.8)否29(85.3)62(78.5)70(88.6)合并痴呆是16(47.1)33(41.8)18(22.8)0.011否18(52.9)46(58.2)61(77.2)左旋多巴等效剂量(mg)542.02±137.44542.55±186.02524.55±182.000.960UPDRS-Ⅱ(分)19.79±12.5517.51±11.0515.77±8.300.350UPDRS-Ⅲ(分)38.59±22.2236.48±22.8631.90±17.380.360UPDRS-Ⅳ(分)3.18±5.102.84±5.552.03±3.720.569H-Y分级2.69±0.992.63±1.012.42±0.800.336ADL(分)49.38±24.0744.66±22.9142.05±20.840.398MMSE(分)23.03±5.9223.92±4.9625.03±4.640.126

2.5.2 按年龄分层不同BST1基因型PD患者临床特点比较 见表5。 取年龄中位数69岁，年龄>69岁PD患者三种基因型间发病年龄、病程、是否单侧起病、首发部位、首发症状、是否合并痴呆、左旋多巴等效剂量、UPDRS-Ⅱ评分、UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、H-Y分级、ADL评分、MMSE评分的分布差异无统计学意义(均P>0.05)。年龄≤69岁PD患者不同BST1基因型间合并痴呆的发生率差异有统计学意义(P=0.038)，PD患者中A/G基因型携带者合并痴呆的的发生率低于A/A基因型和G/G基因型携带者;PD患者发病年龄、病程、是否单侧起病、首发部位、首发症状、左旋多巴等效剂量、UPDRS-Ⅱ评分、UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、H-Y分级、MMSE、ADL差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表5 按照年龄分层,年龄≤69岁、年龄>69岁不同BST1基因型与PD患者临床症状的比较[x±s,例(%)]临床症状年龄≤69岁A/AG/GA/GP值年龄>69岁A/AG/GA/GP值发病年龄(岁)54.36±6.8353.29±7.8552.53±8.320.63470.15±4.5670.16±5.4371.53±4.280.416病程(年)7.93±6.676.40±4.606.07±4.380.8755.70±5.746.19±4.825.12±3.920.355单侧起病 是12(85.7)36(92.3)39(90.7)0.76816(80.0)31(77.5)30(83.3)0.816 否2(14.3)3(7.70)4(9.30)4(20.0)9(22.5)6(16.7)首发部位 上肢12(85.7)27(69.2)23(53.5)0.14014(70.0)26(65.0)28(77.8)0.802 下肢2(14.3)12(30.8)18(41.9)5(25.0)11(27.5)6(16.7) 混合+其他002(4.70)1(5.00)3(7.50)2(5.60)首发症状' 震颤5(35.7)18(46.2)18(41.9)0.2369(45.0)18(45.0)14(38.9)0.060 强直-运动迟缓1(7.10)8(20.5)13(30.2)2(10.0)9(22.5)1(2.80) 混合+其他8(57.1)13(33.3)12(27.9)9(45.0)13(32.5)21(58.3)合并痴呆 是5(35.7)13(33.3)5(11.6)0.03811(55.0)20(50.0)13(36.1)0.312 否9(64.3)26(66.7)38(88.4)9(45.0)20(50.0)23(63.9)左旋多巴等效剂量(mg)568.48±178.53546.46±257.71506.05±211.750.718523.50±100.63538.75±66.84546.65±138.180.828UPDRS-Ⅱ(分)20.71±13.7414.98±10.2213.53±6.100.21419.15±11.9720.38±11.3918.74±9.900.630UPDRS-Ⅲ(分)39.71±24.0829.74±20.3129.02±15.380.18737.80±21.4344.14±23.4435.71±19.300.143UPDRS-Ⅳ(分)5.21±6.732.81±5.542.47±4.340.5781.75±2.992.86±5.641.44±2.670.238H-Y分级2.64±1.102.36±0.88 2.22±0.660.6852.73±0.942.95±1.062.69±0.900.208ADL(分)51.50±25.9939.51±18.24 37.95±17.900.16447.90±23.2149.67±25.9546.94±23.190.975MMSE(分)24.57±5.0825.02±5.1026.91±4.460.23621.95±6.3422.68±4.5422.53±4.970.798

2.5.3 按性别分层不同BST1基因型间PD患者专科临床特点比较 见表6。男性PD患者不同BST1基因型间H-Y分级评分的分布存在统计学差异(P=0.045)，G/G基因型携带者的H-Y分级评分高于A/A基因型和A/G基因型携带者;发病年龄、病程、是否单侧起病、首发部位、首发症状、是否合并痴呆、左旋多巴等效剂量、UPDRS-Ⅱ评分、UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、MMSE评分、ADL评分的分布差异无统计学意义(均P>0.05)。女性PD患者三种基因型间ADL评分的分布差异有统计学意义(P=0.049)，A/A基因型携带者的ADL评分高于G/G基因型和A/G基因型携带者;发病年龄、病程、是否单侧起病、首发部位、首发症状、是否合并痴呆、左旋多巴等效剂量、UPDRS-Ⅱ评分、UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、H-Y分级、MMSE评分的分布差异无统计学意义(均P>0.05)。

表6 按照性别分层,男性、女性群体中不同BST1基因型与PD患者临床症状比较[x±s,例(%)]临床症状男性A/AG/GA/GP值女性A/AG/GA/GP值发病年龄(岁)62.61±9.5461.75±10.1360.30±12.040.86764.81±9.8960.62±11.6661.19±11.380.543病程(年)5.33±4.396.23±4.015.51±4.320.4418.06±7.556.38±5.325.83±4.080.892单侧起病 是14(77.8)32(80.0)41(95.3)0.06814(87.5)35(89.7)28(77.8)0.336 否4(22.2)8(20.0)2(4.70)2(12.5)4(10.3)8(22.2)

续表1临床症状男性A/AG/GA/GP值女性A/AG/GA/GP值首发部位 上肢16(88.9)29(72.5)31(72.1)0.33510(62.5)24(61.5)20(55.6)0.965 下肢2(11.1)11(27.5)12(27.9)5(31.3)12(30.8)12(33.3) 混合+其他0001(6.3)3(7.7)4(11.1)首发症状 震颤7(38.9)19(47.5)15(34.9)0.2907(43.8)17(43.6)17(47.2)0.890 强直-运动迟缓2(11.1)11(27.5)10(23.3)1(6.3)6(15.4)4(11.1) 混合+其他9(50.0)10(25.0)18(41.9)8(50.0)16(41.0)15(41.7)合并痴呆 是8(44.4)19(47.5)11(25.6)0.0968(50.0)14(35.9)7(19.4)0.072 否10(55.6)21(52.5)32(74.4)8(50.0)25(64.1)29(80.6)左旋多巴等效剂量(mg)539.65±162.48565.70±237.45541.46±204.870.882544.69±107.82518.81±109.63504.35±150.610.619UPDRS-Ⅱ(分)17.78±12.2720.35±11.2715.84±7.610.20822.06±12.8714.59±10.1515.69±9.170.095UPDRS-Ⅲ(分)36.39±23.7242.73±22.1034.79±17.160.26241.06±20.8930.08±22.1028.44±17.240.094UPDRS-Ⅳ(分)3.28±4.761.90±4.531.95±3.580.2363.06±5.603.79±6.342.11±3.940.391H-Y分级2.44±0.872.86±0.952.38±0.680.0452.97±1.072.40±1.012.47±0.930.214ADL评分45.0±21.9349.47±25.0541.70±20.420.37954.31±26.1039.72±19.6042.47±21.600.049MMSE(分)24.61±4.9423.23±5.1625.30±4.630.12021.25±6.5624.64±4.7024.69±4.690.068

3 讨 论

众所周知，目前PD发病原因尚不明确，可能是遗传、环境、炎症免疫因素共同作用所致。目前已有研究发现BST1基因主要通过参与神经炎症反应[21]、引起多巴胺神经元细胞内钙离子失衡使得神经元变性导致PD的发生[22]。在动物实验[23]中已证实了敲除BST1基因的小鼠明显表现出抑郁症状、焦虑行为、社交受损，类似于在PD 患者中观察到的症状。目前针对国内外不同地区、不同人群BST1基因多态性与PD相关性的研究[8-20]已经报道，尽管结论各不相同，但尚无新疆人群BST1基因多态性与PD相关性的报道。因此，本研究选择位于BST1基因3′未翻译区的rs4698412位点进行分析，阐述其与新疆地区PD的相关性、对PD患者临床症状的影响。

本研究首先分析了BST1基因rs4698412位点多态性与PD的相关性，结果并未发现该位点三种基因型、两种等位基因频率分布在PD组和对照组间存在差异性(均P>0.05)，说明BST1基因rs4698412位点并不是新疆地区PD的易感基因。这与在我国湖北、湖南、江西、重庆、江苏地区人群中发现rs4698412位点A等位基因、AG+AA基因型可增加PD风险的研究[10,13-14,17]结果有所不同，与国外在日本人、美国人、法国人和澳大利亚人群中发现rs4698412位点多态性可导致PD发病风险升高的研究[7,9,19]结论不一致，而与研究[11，16]中未发现rs4698412位点与PD发病存在相关性的结论相同。研究结论的不一致可能与人群种族和环境、研究样本量和方法不同有关。

本研究进一步分析了新疆地区rs4698412位点不同基因型与PD患者临床症状关系的相关性。结果发现，总体样本中，PD患者中A/G基因型携带者合并痴呆的发生率(22.8%)低于A/A基因型携带者(47.1%)和G/G基因型携带者(41.8%)，差异有统计学意义(P=0.011)。按年龄分层后，这种趋势在年龄≤69岁PD患者中仍然存在，年龄≤69岁的PD患者中A/G基因型携带者合并痴呆的发生率(11.6%)低于A/A基因型(35.7%)和G/G基因型(33.3%)携带者，差异有统计学意义(P=0.038)，提示新疆地区PD患者BST1基因A/G基因型携带者合并痴呆的发生率低于A/A基因型和G/G基因型携带者，按年龄分层后，这种趋势主要在年龄≤69岁的PD患者中存在。按照性别分层后发现，男性PD患者在三种基因型间病程无差异的情况下，G/G基因型携带者的H-Y分级评分[(2.86±0.95)分]高于A/A基因型[(2.44±0.87)分]和A/G基因型[(2.38±0.68)分]携带者，差异有统计学意义(P=0.045)，提示男性PD患者BST1基因G/G基因型携带者的病情进展速度可能较A/A基因型和A/G基因型携带者快。女性PD患者在三种基因型间病程、病情程度(H-Y评分)分级无差异的情况下，A/A基因型携带者的ADL评分[(54.31±26.10)分]高于G/G基因型[(39.72±19.60)分]和A/G基因型[(42.47±21.60)分]携带者，差异有统计学意义(P=0.049)，提示女性PD患者BST1基因A/A基因型携带者的日常生活能力损害可能较G/G基因型和A/G基因型携带者严重。本研究结果与谢笛[13]和崔璨等[17]的研究结论相比较，部分结果相似，也有部分结果不同，这可能与对PD患者临床资料的关注点和分析角度不同有关。谢笛[13]分析的临床资料包括发病年龄、主要症状类型，崔璨等[17]分析的临床资料包括病程、发病年龄、H-Y分级、首发肢体、运动障碍类型。关于发病年龄，本结果与前述研究[13,17]的结论一样，并未发现病程在rs4698412位点三种基因型间存在不同；关于病程、首发肢体的情况，本研究与之前研究[17]的结论一致，没有发现这两个临床资料在三种基因型间存在差异；关于H-Y分级，本研究在总体PD样本中的分析结果与崔璨等[17]的结论相似，都没有发现病情程度分级(H-Y分级)评分在三种基因型间存在差别，但当本研究进一步按性别分层后发现，在男性PD患者中的不同基因型间病情程度H-Y分级评分存在不同；关于是否合并痴呆、ADL评分的比较，这是在之前的两项研究[13,17]中没有被关注的。

本研究结果在其他研究中尚未见相关阐述，对新疆地区PD的临床防治可能有一定的指导意义。虽然在样本、质量控制、研究方法等方面尽力做到结果可靠，但仍有不足之处：(1)仅在一个地区研究，由于民族、地域等影响，可能导致其他人群中无法重复该结果。(2)样本量偏小，尚需多中心、大样本研究进行反复验证。(3)对于本研究结论发生的原因尚不能做到很好的解释，有待于今后进一步深入研究。