中药复方调控GRP78、CHOP改善代谢综合征大鼠内质网应激的实验研究

黄理安，黄孝静，罗保平

代谢综合征(metabolic syndrome，MS)是以中心性肥胖、脂代谢异常、高尿酸、高血压为主要特征，胰岛素抵抗为共同的病理生理基础，多种物质代谢异常的一组复杂证候群，是1型糖尿病和心脑血管疾病的代谢性危险因素，但病因和发病机制尚未明确[1]。MS主要临床表现为肥胖、高血压、胰岛素抵抗等靶器官损伤[2]，这些心血管危险因素聚集表现为对肾脏损害有协同作用[3]，肾脏损伤的临床表现为肾小球滤过率高，尿清蛋白排泄率增加，肾小管功能改变[4-5]。中医学认为，肾藏精，精血互生，以养肝木，疏肝理气；肾精不足，阴虚阳亢，以致肝失疏泄，气化失司，中焦气机壅滞，运化失常，加重体内痰湿，导致肥胖及血脂紊乱更甚[6]。因此，MS不仅导致心血管事件发生危险增加，同时损害肾脏，肾脏损害又反之加重MS的心血管并发症，因此，肾脏损害的早期发现和治疗应受到高度重视[7]。

临床治疗MS的原则以逆转糖代谢异常、脂代谢紊乱、高血压、胰岛素抵抗、降低心血管风险等为主，常用的药物以西药居多，但治疗时常出现副作用：西布曲明可能导致神经性厌食症，奥利司他可能导致脂溶性维生素缺失，噻嗪类利尿剂可能诱发胰岛素抵抗从而升高血糖及三酰甘油水平，导致电解质紊乱，β受体阻滞剂可能抑制胰岛素分泌而诱发糖尿病。由于该病的影响因素较多，使疗效难以满意。中药复方对MS的防治已广泛应用于临床[8]。小檗碱作为常用药物的主要有效成分，可发挥提高胰岛敏感性、降低血糖、改善脂质紊乱的作用[9]。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞中一种重要的亚细胞器，主要功能为调节蛋白质的合成、折叠、运输及修饰，当某些错误折叠蛋白的积聚引起内质网一系列功能的紊乱，称为内质网应激，是MS肾损害的重要发病机制之一[10]。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、内质网应激蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)参与了这一病理过程[11]，血尿酸(blood uric acid，UA)与MS肾损害密切相关[12]。本研究观察中药复方对MS大鼠空腹胰岛素(FINS)水平、血脂含量、血UA及肾小管组织GRP78、CHOP表达的影响，以期为临床诊治MS大鼠肾损伤提供理论依据和实验参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药品 中药复方：黄连15 g，黄芪20 g，地黄10 g，五味子10 g，苍术15 g，茯苓15 g，麦冬10 g，共95 g，饮片均由江中饮片厂生产，制成粗粉，与适量水煮沸30 min，粗滤，反复3次，滤液合并浓缩至30 mL，稀释至0.2 g/mL水煎液备用。小檗碱溶液：精密称取盐酸小檗碱，以甲醇溶解并稀释制成0.04 μg/mL标准溶液备用。

1.1.2 实验动物 2月龄Wistar大鼠80只，饲养于动物中心清洁级动物室，体质量160～180 g，实验动物使用许可证编号：SYXK(鄂)2017-0067，由湖北中医药大学实验动物伦理委员会同意批准实施。实验过程严格遵循3R原则给予实验动物人道关怀照顾。

1.1.3 实验试剂 果糖(Amres-co，美国)；盐酸小檗碱(北京中新制药厂，国药准字H11020962)；鼠抗GRP78多抗(novus，货号：H00003309-A01)；兔抗CHOP mAb(Sino Biolgical，美国)；山羊抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多抗(Sino Biolgical，美国)。

1.1.4 实验仪器 小动物无创血压测量仪购自上海欣软科技有限公司；AU2700全自动生化分析仪购自日本Olympus公司；SMZ645型光学显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型建立 将80只2月龄Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、中药组、小檗碱组，每组20只。适应性饲养1周，对照组予以普通饮食及饮用净化自来水，其余大鼠用10%果糖水代替正常饮水，持续8周。8周后应用两因素重复测量方差分析，对血脂、血压及空腹胰岛素水平差异有统计学意义的造模大鼠，认为造模成功。用药剂量根据《药理实验方法学》[12]中按“人与动物体表面积折算”，中药组以中药复方1.0 g/(kg·d)灌胃，每日1次；小檗碱组以小檗碱100 mg/(kg·d)灌胃，每日1次；对照组及模型组予以等体积生理盐水灌胃，持续8周。干预8周后测量各组大鼠生化指标、胰岛功能、血压水平。

1.2.2 大鼠尾动脉收缩压测定 各组大鼠第2周开始于清醒、安静状态下，采用无创血压测量仪，测量清醒状态下大鼠尾动脉收缩压。

1.2.3 血清指标检测 实验结束后，大鼠禁食12 h，麻醉后腹主动脉取血，采用酶比色法测定血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、UA和空腹血糖(FBG)含量；放射免疫法测定血清FINS水平。

1.2.4 样本收集 断颈处死各组大鼠，留取血液样本，取一侧肾脏，部分置于10%多聚甲醛中固定，-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 肾脏组织病理学检查 肾脏组织经10%甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋后，制成3 μm的石蜡切片，进行苏木精、糖原(PAS)染色，光学显微镜下观察各组肾脏微细结构变化。

1.2.6 实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测GRP78、CHOP的mRNA表达水平 取冷冻的肾脏，用预冷的裂解液进行组织匀浆，离心收集上清液，依次加入三氯甲烷及异丙醇进行萃取，萃取后离心得到RNA沉淀，之后用75%乙醇洗涤2次后晾干，加入DEPC水溶解得到RNA溶液，按照反转录试剂盒操作方法将其合成为cDNA。依据设计的GRP78、CHOP引物，采用RT-PCR试剂盒及基因特异性引物进行反应，根据反应曲线计算mRNA表达量，以GAPDH为内参，以各条带光密度与GAPDH条带的比值作为相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 各组大鼠生化指标及收缩压比较 与对照组大鼠比较，模型组大鼠FBG、FINS、TG、TC、收缩压、BUN及Scr水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组和小檗碱组生化指标及收缩压均有不同程度下降，且中药组下降程度更显著(P<0.05)。详见表2。

2.2 各组大鼠肾脏微细结构变化 与对照组比较，模型组大鼠肾小球局灶节段性系膜基质增多，肾小管上皮细胞肿胀，内质网减少；中药组、小檗碱组大鼠肾组织病理改变均较模型组轻微，其中中药组大鼠仅见轻度系膜细胞增生和基质增多，肾小管炎性细胞浸润基本消失；小檗碱组大鼠肾组织病理仅见少量系膜细胞增生。详见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织形态结构(HE染色，×400)

2.3 各组大鼠肾组织GRP78、CHOP mRNA表达水平比较 模型组GRP78、CHOP mRNA表达高于对照组(P<0.01)；与模型组相比，中药组和小檗碱组GRP78、CHOP mRNA表达减少(P<0.05)，且中药组表达少于小檗碱组(P<0.05)。详见图2、表3。

图2 各组大鼠肾组织GRP78、CHOP mRNA表达条带图

表3 各组大鼠肾组织GRP78、CHOP mRNA表达水平比较(±s)

3 讨 论

有研究显示，MS作为一种代谢性疾病，其发病率及致死率均逐步升高，威胁我国人民的健康[13]。目前治疗MS无标准指南，临床主要是针对各项危险因素进行有效干预。中医学以预防肾损害为主，充分体现了未病先防、既病防变的治未病思想和理念。中医药治疗或改善MS诸症，取得了一定的疗效，相关中药复方和活性成分的研究和新药开发取得了一定程度的进展[14]。有研究显示，从黄连中提取出的小檗碱通过降糖、降脂、纠正代谢紊乱等改善胰岛素抵抗，达到防治MS的目的，黄连中的多种复合成分针对MS的多靶点治疗优于小檗碱已被证实[15]。有研究通过超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱技术探讨黄芪汤中的潜在活性成分，鉴定出了17种提示肾病综合征的生物标志物，同时，筛选出治疗肾病综合征的活性成分，如芬芳因G加氢、粉防己碱、芳胆碱、甘草酸等[16]，中药复方在治疗MS中发挥了重要作用。

本研究结果显示，中药复方、小檗碱均能降低MS大鼠FBG、FINS、TG、TC、收缩压、BUN、UA及Scr水平，其中，中药组各指标水平降低更显著；显微镜观察可见中药组大鼠肾组织病理改变较MS大鼠显著改善，说明中药复方对减轻MS大鼠的肾损害有确切的疗效。GRP78在缓解内质网应激方面发挥着重要的作用，GRP78表达上调具有内质网应激特异性，可作为内质网应激的标志性因子[17]。早期研究发现，以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射引起正常小鼠肾脏内质网应激，并导致肾脏功能损害，而CHOP mRNA敲除小鼠存在严重的肾脏损害[18]。因此，推测肾功能损害与内质网应激引起的CHOP有关，CHOP是介导内质网应激所致细胞损伤的重要转录因子[19]。本研究结果显示，与模型组比较，中药组、小檗碱组大鼠肾组织GRP78及CHOP mRNA表达均有不同程度减少，其中，中药组两种基因表达减弱显著，接近对照组大鼠。为此提出假说，中药复方可能通过调节GRP78及CHOP基因的表达而作用于内质网应激反应，以此减轻MS诱导的内质网应激肾脏细胞损伤而发挥作用。分析原因可能与中药复方的药理作用有关。詹玫琦等[20]实验研究显示，黄连可改善大鼠糖脂代谢紊乱，降低血糖和血脂及内质网应激GRP78、CHOP蛋白的表达。Zhou等[21]研究证实，黄连碱通过抑制内质网应激和氧化应激，减轻内皮功能障碍，改善血管功能，从而减轻细胞损伤。张晓凤等[22-23]研究发现，黄芪甲苷可降低高糖诱导的GRP78、CHOP高表达，抑制H9c2细胞内质网应激，缓解CHOP介导的细胞过度凋亡，从而改善MS诱导的大鼠肾脏细胞凋亡。药理研究发现，地黄具有抗氧化、抗凋亡等作用，其有效成分可抑制内质网应激，减少细胞损伤[24-25]。Cheng等[26-27]研究显示，采用不同浓度的五味子乙素干预后，细胞相对存活率升高，且GRP78、CHOP水平降低，提示五味子乙素通过抑制内质网应激减轻细胞损伤。王清华等[28]研究显示，苍术可减轻细胞炎性水肿，降低细胞上清液中炎性细胞介质含量和细胞内GRP78高表达，抑制细胞内质网应激。多项研究显示，茯苓的有效成分如茯苓多糖、茯苓酸等均可抑制细胞内质网应激，减轻炎症反应[29-30]。细胞实验显示，麦冬皂苷D可降低内质网应激，对细胞发挥保护作用[31]。

中药复方治疗MS所致肾损害，调节GRP78及CHOP基因的表达，有可能成为干预和治疗MS的有效措施，为MS肾损害的治疗提供新思路和新方法。