秦艽对脑缺血再灌注损伤大鼠RAS/RAF通路及神经功能障碍的影响

张华军，刁正文，杜春富，李秋霖

缺血性脑卒中又称为脑梗死，是临床心脑血管科的一种常见疾病，是由于血管堵塞引起脑部供血不足，进而脑组织局部出现坏死的疾病，该病发病急，病情进展迅速，致死率、致残率较高，若治疗不及时，易造成偏瘫等，甚至导致死亡[1-2]。炎症反应在脑梗死病情进展中发挥着重要作用，抑制炎症可减轻脑缺血再灌注后脑损伤[3]，是治疗缺血性脑卒中的有效手段。秦艽是一种传统中药，具有清除自由基、抗炎、抗氧化的药理作用，可提高肝脏抗氧化应激水平，抑制肝脏炎症，对脂肪肝及痛风性关节炎大鼠均有较好的治疗效果[4-5]。大鼠肉瘤(RAS)/加速纤维肉瘤(RAF)通路在体内氧化应激、炎症反应、DNA损伤等病理过程中发挥着重要的调控作用，激活RAS/RAF信号通路，可增强下游细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平，引发炎症，造成肝细胞损伤[6-7]，通过下调RAS表达，抑制炎症缓解脑缺血再灌注损伤[8]，由此可知RAS/RAF信号通路可能是治疗缺血性脑卒中的靶点。本研究观察秦艽对脑缺血再灌注损伤大鼠RAS/RAF通路及神经功能障碍的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠购自广州中医药大学动物实验中心[SCXK(沪)2020-0002]，雄性，体质量180～220 g，清洁级，在温度23～25 ℃，湿度50%～60%的动物房中饲养。

1.1.2 实验试剂及仪器 秦艽(货号DYQ8080)由上海恒斐生物科技有限公司提供；尼莫地平(货号D14202003034)由山东新华制药股份有限公司提供；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(货号298964)由Amresco公司提供；大鼠白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(货号EK0412)由上海彩佑实业有限公司提供；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(ab245880)、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(货号ab100785)、RIPA裂解液(货号ab288006)、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白检测试剂盒Ⅱ(货号ab287853)、兔源RAS一抗(货号ab52939)、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗(货号ab181602)、兔源RAF一抗(货号ab137435)、兔源p-RAF一抗(货号ab173539)、兔源ERK1/2一抗(货号ab32537)、兔源p-ERK1/2一抗(货号ab192591)、羊抗兔二抗(货号ab150077)，由美国Abcam公司提供；十二烷基酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒(货号P1200)、TBST缓冲液(货号T1081)，由北京索莱宝公司提供。酶标仪(型号XElx800)购自美国Perkin Elmer公司；光学显微镜(型号SMZ745)购自日本尼康公司；切片机(型号CM3050S)购自德国Leica公司；小型蛋白电泳仪(型号1659001)、转膜仪(型号Trans-Blot Turbo)购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 脑缺血再灌注大鼠模型制备及分组 参照文献[9]制备脑缺血再灌注大鼠模型：取65只SD大鼠，向腹腔内注入45 mg/kg的2.5%戊巴比妥钠溶液，待大鼠深度麻醉后脱去颈部毛发，75%乙醇消毒后逐层剪开颈部皮肤与肌肉，找到右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)，游离后将CCA与ECA近心端结扎，同时夹闭ICA，于ECA近分叉处剪一个小切口后插入直径0.24 mm的栓线，放开ICA，继续插入拴线直到大脑中动脉起始处，将拴线尾端暴露于外后，逐层缝合，缺血2 h后，抽出栓线，再灌注48 h，大鼠模型制备完成。待大鼠苏醒后进行神经功能缺损评分，参照Longa分级标准[10]：0分为大鼠神经功能无缺损；1分为大鼠对侧前爪不能伸展完全；2分为大鼠行走时向对侧转圈；3分为大鼠行走时向对侧倾倒；4分为大鼠不能自发行走，意识丧失；5分为大鼠死亡。神经功能缺损评分1～3分为大鼠模型制备成功，共60只，随机分为模型组、尼莫地平组、秦艽低剂量组、秦艽中剂量组、秦艽高剂量组，每组12只；取12只正常SD大鼠切开颈部游离CCA、ECA、ICA，但不插栓线，作为假手术组。

秦艽生药材经粉碎后以95%乙醇溶液(比例为1∶9)浸泡24 h，置于冷凝回流装置中，加热回流3 h，过滤后采用旋转蒸发仪将滤液中的乙醇完全蒸发，即得到秦艽提取物浸膏，参照文献[11]剂量作为人鼠剂量换算后给药：秦艽提取物溶解于蒸馏水中分别制成质量分数为0.1 g/mL、0.4 g/mL、0.8 g/mL的药液，秦艽各剂量组大鼠每日以10 mL/kg剂量灌胃，将尼莫地平[12]配制为浓度1 mg/mL溶液，尼莫地平组大鼠灌胃10 mL/kg尼莫地平溶液，假手术组与模型组大鼠灌胃10 mL/kg生理盐水。每组每日治疗1次，持续7 d。

1.2.2 大鼠神经功能缺损、脑梗死面积测量及标本收集 各组大鼠末次给药后24 h，参照Longa分级法进行神经功能缺损评分。使用5 mL注射器刺入各组大鼠尾静脉取血2 mL，静置后，以3 000 r/min，4 ℃离心15 min，收集上清液，储存于-80 ℃备用。各组分别取6只大鼠断头处死，取出大脑，沿冠状切面切成5片，厚度大致相同，以2%的TTC染液浸没切片染色(室温，避光，30 min)，蒸馏水漂洗后固定(4%多聚甲醛，4 ℃，过夜)，采集切片图像后采用Image pro软件计算脑梗死面积，脑梗死面积(%)=全脑梗死面积/全脑片面积×100%。各组剩余的6只大鼠断头处死后分离脑组织，剪取约1.5 g置于RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制剂)中，使用匀浆机制备匀浆液，以3 000 r/min，4 ℃，离心20 min，取上清液，采用BCA法测定各组样品中总蛋白浓度，具体操作参照BCA试剂盒说明书进行，储存于-80 ℃备用。

1.2.3 大鼠海马组织苏木精-伊红(HE)染色 剩余脑组织，固定(4%多聚甲醛，4 ℃，过夜)、脱水(80%、90%、95%、100%乙醇依次孵育)，采用二甲苯孵育透明，以热石蜡包埋成块后固定在切片机中进行病理切片，二甲苯孵育脱蜡、100%、95%、90%、80%梯度乙醇水化，参照HE试剂盒说明书进行HE染色后漂洗、脱水、透明、封片，采用光学显微镜观察海马神经元形态。

1.2.4 大鼠脑组织IL-6、TNF-α水平检测 取出1.2.2中的脑组织蛋白样品液，冰水浴中缓慢解冻后采用ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-α水平，参照说明书操作。

1.2.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠脑组织RAS/RAF通路相关蛋白表达 将1.2.4中剩余的各组蛋白样品液根据1.2.2将浓度调至相同后，取20 μL，采用电泳分离蛋白，之后通过湿转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室温孵育5%脱脂奶粉溶液2 h，兔源GAPDH、RAS、RAF、p-RAF、ERK1/2、p-ERK1/2一抗4℃孵育过夜，稀释比例分别为1∶2 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000，TBST漂洗3次后以羊抗兔二抗室温孵育2 h，稀释比例为1∶2 000，TBST漂洗3次后化学发光法显色，以Quantity One软件分析量化各组蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 秦艽提取物对大鼠神经功能的影响 模型组与假手术组比较，大鼠神经功能缺损评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)。秦艽各剂量组、尼莫地平组较模型组大鼠神经功能缺损评分降低，且秦艽各剂量组呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；秦艽高剂量组与尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组神经功能缺损评分比较(±s) 单位：分

2.2 秦艽提取物对大鼠脑梗死的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死面积增加，差异有统计学意义(P<0.05)。秦艽各剂量组、尼莫地平组较模型组大鼠脑梗死面积减小，且秦艽各剂量组呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)；秦艽高剂量组与尼莫地平组大鼠脑梗死面积比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1、表2。

图1 各组大鼠脑组织TTC染色结果

表2 各组大鼠脑梗死面积比较(±s) 单位：%

2.3 秦艽提取物对大鼠海马神经元的影响 假手术组大鼠海马神经元无病理损伤。模型组大鼠海马神经元皱缩坏死、分布散乱、数量减少，呈严重的病理损伤；秦艽各剂量组、尼莫地平组较模型组大鼠海马神经元病理损伤减轻，且病理损伤程度随着秦艽剂量增加而减轻；秦艽高剂量组与尼莫地平组海马神经元病理损伤程度无明显差异。详见图2。

图2 各组大鼠脑组织海马神经元ca1区HE染色图(×200)

2.4 秦艽提取物对大鼠脑组织TNF-α、IL-6含量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-6含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。秦艽各剂量组、尼莫地平组较模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-6含量降低，且秦艽各剂量组呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)；秦艽高剂量组与尼莫地平组脑组织TNF-α、IL-6含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-6含量比较(±s，n=12) 单位：pg/g

2.5 秦艽提取物对大鼠脑组织RAS/RAF通路相关蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织RAS/RAF通路相关蛋白RAS表达水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2升高，差异有统计学意义(P<0.05)。秦艽各剂量组、尼莫地平组较模型组大鼠脑组织RAS表达水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2水平降低，且秦艽各剂量组呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；秦艽高剂量组与尼莫地平组大鼠脑组织RAS表达水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图3、表4。

图3 各组大鼠脑组织RAS/RAF通路相关蛋白条带图(A为假手术组；B为模型组；C为秦艽低剂量组；D为秦艽中剂量组；E为秦艽高剂量组；F为尼莫地平组)

3 讨 论

近年来，脑卒中发病率呈升高趋势，治疗窗口期短，预后差，多数病人丧失活动及语言功能，引发偏瘫等神经功能障碍，极大影响病人的身心健康，造成沉重的经济负担[13]。脑卒中病人血栓形成后，脑组织缺血缺氧及血液再灌注促使TNF-α、IL-6等促炎因子大量合成，诱发炎症，致使神经细胞坏死、凋亡，是造成脑卒中病人脑损伤及神经功能障碍的主要致病机制[14]。本研究以大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注模型，结果显示，相较于假手术组，造模大鼠海马神经元数量减少，分布散乱且皱缩坏死，表现为严重的病理损伤，且神经功能缺损评分、脑梗死面积、脑组织IL-6、TNF-α水平均升高，表明造模大鼠脑内促炎因子大量合成分泌，引发神经炎症，致使海马神经细胞凋亡，损伤大鼠神经功能，提示脑缺血再灌注模型建立成功。

中医学称脑卒中为中风，机体正气亏虚、外风入侵、耗伤正气、筋脉阻滞不通是发病机制。秦艽有祛风除湿、舒筋活血的功效，可减少机体自由基，降低氧化应激水平，抑制炎症，改善风湿关节炎症状，并对脑卒中后上肢痉挛性瘫痪具有较好的疗效[15-17]，但具体的作用机制尚未明确。RAS/RAF是机体调控炎症反应的重要通路，RAS蛋白在细胞外信号刺激下，可磷酸化激活RAF，进而促使ERK磷酸化，引起炎性因子合成分泌增加，诱发炎症，降低RAS表达，减弱RAF、ERK磷酸化水平，抑制星形胶质细胞激活和炎症发生发展，进而减少神经细胞凋亡，改善神经功能缺损，缓解脑损伤[18-20]，因而推测秦艽改善脑卒中后脑损伤及神经功能障碍的作用机制可能是下调RAS/RAF信号。

本研究采用秦艽提取物处理脑缺血再灌注模型大鼠，结果显示，相较于模型组，秦艽各剂量组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、脑组织IL-6和TNF-α水平、RAS/RAF通路相关蛋白RAS表达水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2均降低，海马神经元病理损伤均减轻，且秦艽各剂量组呈剂量依赖性，表明秦艽提取物可下调RAS/RAF信号表达，减少促炎因子合成，抑制炎性反应，减小脑缺血再灌注大鼠脑梗死面积，减轻海马神经元损伤，修复神经功能障碍。

综上所述，秦艽提取物可抑制脑缺血再灌注后大脑炎症反应，减轻海马神经细胞损伤，改善大鼠神经功能障碍，抑制RAS/RAF信号通路传导可能是其作用机制。本研究为秦艽应用于脑卒中的临床治疗提供了实验依据，但未深入探讨药理机制，未采用RAS/RAF通路抑制剂和激活剂进行对照验证，今后需进一步深入研究。