基于网络药理学探讨水蛭治疗急性心肌梗死的作用机制

欧阳嘉慧，孟闫燕，张 帆，林宫羽，杜天依，李立志，高铸烨

心肌梗死是一种由心肌氧供需失衡导致心肌细胞死亡的综合征，继发于急性动脉粥样硬化斑块破裂或无动脉粥样硬化斑块形成时心肌氧供应和/或需求失衡[1]。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)临床表现为持续性胸痛及大汗，伴乏力、恶心、呼吸短促、肩颈部放射性疼痛等不适，少部分病人无急性症状[2]。随着循证医学的发展及生活方式的改善，心肌梗死患病率、死亡率得到有效控制，但AMI仍具有高患病率、高死亡率、高致残率的特点[2]。中医学根据AMI的症状特点，将其归属于“厥心痛”“胸痹心痛”“真心痛”等范畴。中医学认为真心痛多与年老体衰、过食肥甘、烟毒损害、寒邪侵袭有关，导致人体血瘀痰浊，闭塞心脉，心脉不通，发为心痛[3]。中药水蛭始载于《神农本草经》，为水蛭科动物蚂蟥、水蛭或柳叶蚂蟥的干燥全体，其味咸苦，性平，具有破血通经、逐瘀消癥的功效[4]。现代药理研究显示，水蛭具有抗炎、抗血栓、抗凝、调节脂代谢、保护内皮细胞等生物活性，对治疗AMI有积极的作用，但作用机制尚未明确[5]。本研究运用网络药理学方法探讨水蛭治疗AMI的潜在机制和靶点，以期为实验研究及临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 水蛭活性成分的筛选及靶点预测 通过BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)，以“shui zhi”为检索词，设定“药物-靶点”相似性模型阈值Score cutoff≥20、Pvalue≤0.05为阈值，检索筛选水蛭的活性成分及其潜在靶点。

1.2 AMI相关靶点的获取 以“acute myocardial infarction”为关键词，检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)，在GeneCards数据库中筛选出相关性分数(relevance score)≥10的靶点，与另外3个数据库检索出的靶点合并、去重、整理后得到AMI的相关靶点。

1.3 “药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络的构建 利用Venny 2.1.0在线工具，将AMI的疾病靶基因与水蛭活性成分对应的靶基因进行映射后构建韦恩图，获得两者的共同靶点，即为水蛭活性成分治疗AMI的潜在作用靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图。

1.4 水蛭活性成分与AMI共同靶点的蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建 将水蛭与AMI的共同靶点导入STRING数据库(https://www.string-db.org/)，物种限定为人类(Homo sapiens)，设定最低相互作用阈值为中等置信度(medium confidence)0.400，其余参数保持不变，获取PPI网络数据。将PPI网络数据的结果保存为TSV格式后，导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制水蛭活性成分与AMI的共同靶点PPI网络图。

1.5 基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes，KEGG)通路富集分析 将水蛭治疗AMI的潜在作用靶点导入Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html)，设定Pvalue<0.01、min overlap≥3、min enrichment≥1.5为筛选阈值，对导入的作用靶点分别进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析，探讨水蛭治疗AMI的潜在作用机制。

2 结 果

2.1 水蛭的活性成分及靶点 通过检索BATMAN-TCM数据库，设定Score cutoff≥20 及Pvalue≤0.05为筛选阈值，获得水蛭的有效成分15个，其中2个有效成分未检索到相关的靶点，故进行靶点预测时将其舍去；最终筛选出13个水蛭的活性成分；13个活性成分对应449个靶基因，剔除重复值后，共获得水蛭活性成分潜在作用靶基因342个，活性成分信息见表1。

表1 水蛭活性成分

2.2 AMI靶点的获取 通过检索GeneCards数据库(设定相关性分数≥10为筛选阈值)、OMIM数据库、TTD数据库、DrugBank数据库，检索出AMI的疾病相关靶点分别为606个、205个、3个、33个，剔除重复靶点后，最终获得AMI疾病靶基因783个。

2.3 “药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络的构建 将水蛭13个活性成分对应的342个靶基因与783个AMI疾病靶基因在Venny 2.1.0 在线工具中进行映射后构建韦恩图，获得64个药物-疾病共同靶点，推测其为水蛭治疗AMI的潜在作用靶点，详见图1。将64个作用靶点及对应的水蛭13个活性成分导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图，详见图2。其中度值(Degree值)较高的活性成分为藏红花酸、熊果酸、D-甘露庚酮糖、L-半乳庚酮糖，这些成分可能是水蛭治疗AMI的主要活性成分。

图1 水蛭活性成分-AMI靶点韦恩图

图2 水蛭治疗AMI的“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图(绿色箭头为水蛭活性成分；粉红色八边形为靶点)

2.4 PPI网络的构建与分析 将64个水蛭治疗AMI的作用靶点导入STRING数据库中，获取PPI网络数据，并将结果保存为TSV格式后，导入Cytoscape 3.7.2软件中，绘制水蛭活性成分与AMI的共同靶点PPI网络图，详见图3。PPI网络图中共有64个节点、342条相互作用连线，节点平均度值为10.7；根据度值大小筛选出PPI网络中度值居前10位的作用靶点，分别为胰岛素(INS)、清蛋白(ALB)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1β(IL1β)、血管紧张素转化酶(ACE)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)、脂联素(ADIPOQ)、CC趋化因子配体2(CCL2)、胰岛素样生长因子1(IGF1)，居前6位的度值均≥25，提示这些靶点可能是水蛭治疗AMI的潜在核心靶点，详见图4。

图3 水蛭治疗AMI作用靶点的PPI网络图

图4 水蛭治疗AMI的作用靶点(度值居前20位)

2.5 GO功能富集分析 通过Metascape数据库对水蛭治疗AMI的64个作用靶点进行GO功能富集分析，共得到86个条目，其中59个与生物过程(biological process，BP)相关，9个与细胞组分(cellular component，CC)相关，18个与分子功能(molecular function，MF)相关。GO功能富集分析结果显示：水蛭治疗AMI主要涉及血液循环、炎症反应、脂质定位的调节、系统过程的调节、分泌物的调节、对氧水平的反应等生物过程；涉及膜筏、质膜外侧、肌膜、内质网腔、突触前膜的组成部分、整合素复合物等细胞组分；涉及核受体活性、受体调节活性、有机酸结合、血红素结合、整合素结合、转录因子结合等分子功能。详见图5。

图5 水蛭治疗AMI的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 通过Metascape数据库对水蛭治疗AMI的64个作用靶点进行KEGG通路富集分析，共得到20条富集通路，详见图6、表2。相关基因主要富集在非酒精性脂肪肝、癌症、癌症中的蛋白聚糖等疾病通路、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶(cGMP-PKG)等通路。提示上述通路可能是水蛭发挥治疗AMI的核心通路。

图6 水蛭治疗AMI的KEGG信号通路富集分析

表2 水蛭治疗AMI的KEGG通路

3 讨 论

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病，居全球人类死亡原因首位[6]，AMI是冠心病的严重表现之一。《中国心血管健康与疾病报告2020概要》指出，从2005年开始，我国AMI死亡率呈快速升高趋势，2002年—2018年，城市地区AMI死亡率从16.46/10万升至63.33/10万，农村地区AMI死亡率从12.00/10万升至78.47/10万[7]。目前，现代医学治疗AMI包括药物、经皮冠状动脉介入(PCI)、冠状动脉旁路移植，但存在心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion，IR)、手术治疗风险较高等不足。中医学认为真心痛的主要病机为血瘀痰浊、闭塞心脉，治疗原则多以活血化痰、祛瘀止痛为主[8]。水蛭具有破血通经、逐瘀消癥之功效[9]，张锡纯称其“破瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而瘀血默消于无形，真良药也”。脂质堆积、血小板过度激活、胰岛素抵抗、体重增加是动脉粥样硬化发生发展和动脉粥样硬化不稳定斑块破裂的危险因素，炎症、氧化应激是心肌梗死和心肌缺血再灌注后继发性损伤的重要机制[10]。因水蛭含有高效抗凝血物质，具有抗氧化应激、抗炎、调节脂代谢及抗血小板聚集等功效[11-12]，其防治AMI受到越来越多的关注。本研究采用网络药理学方法探讨水蛭治疗AMI的活性成分、潜在作用靶点和作用通路，为今后的研究提供方向和思路。

本研究共筛选出水蛭活性成分13个、对应靶点342个。其中，水蛭与AMI的共同靶点64个，结合“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图结果显示，藏红花酸、熊果酸、L-半乳庚酮糖、D-甘露庚酮糖等是与AMI相关疾病靶点作用最多的活性成分，提示这些成分可能与水蛭发挥治疗AMI的作用机制密切相关。藏红花酸具有改善缺氧组织的氧合、抗氧化应激、抗炎症等多种药理学作用，通过抑制心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺氧复氧后Nox2活性，减少CMECs细胞内活性氧(ROS)水平，从而发挥缓解CMECs缺血再灌注损伤的作用，通过抑制线粒体Ca2+浓度升高，保护心肌线粒体结构损伤及功能[13-14]。熊果酸通过降低溶酶体损伤和(或)增加溶酶体稳定性，从而减轻心肌缺血后溶酶体酶释放导致的心肌细胞损伤和死亡，通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)和转化生长因子β(TGF-β)表达，从而抑制心肌纤维化[15]。根据PPI网络分析发现，水蛭治疗AMI的靶基因中，度值较高的为INS、ALB、TNF、IL1β等，推测其为水蛭抗AMI的核心靶点。INS是机体内唯一降低血糖的激素，由胰脏的胰岛β细胞分泌。相关研究显示，INS抵抗及高INS分泌可能影响机体炎症反应、氧化应激程度，增加肥胖、糖尿病、高脂血症发生风险，影响一氧化氮(NO)合成及生物利用度，损害血管内皮结构完整性，刺激血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移和增殖，促进动脉粥样硬化斑块形成，最终发展为冠心病、心肌梗死[16-18]。ALB是一种负性急性时相反应蛋白，低清蛋白水平是首发AMI病人全因死亡率、心血管死亡率和心脏死亡率的独立预测因子，可能与其抗炎症反应的作用受限有关[19-20]。TNF-α和IL1β是重要的促炎症细胞因子；梗死心肌局部TNF-α升高可诱导活跃的局部炎症反应、基质和胶原降解及MMPs活性增加，导致急性心肌破裂和慢性左心室功能障碍[21]。IL1β是白细胞介素-1基因家族的主要成员，通过诱导趋化因子造成血管内皮损伤，增加成纤维细胞胶原酶表达，抑制TGF-β信号转导，导致心肌重塑不良，且与AMI后心脏破裂密切相关[22-23]。水蛭通过调节INS、ALB、TNF、IL1β等靶点发挥治疗AMI的作用。

GO功能富集分析显示，水蛭治疗AMI的功能主要体现在核受体活性、受体调节活性、有机酸结合、血红素结合、整合素结合等分子功能；血液循环、炎症反应、脂质定位、系统过程、分泌物、对氧水平的反应等生物过程；涉及膜筏、质膜外侧、肌膜等细胞组分。

KEGG通路富集分析显示，水蛭通过对20条AMI相关通路的作用达到治疗AMI的目的，其中包括疾病通路和信号通路。主要疾病通路包括非酒精性脂肪肝、癌症通路、癌症中的蛋白聚糖等。非酒精性脂肪肝参与并增强机体内氧化应激反应及炎症反应，诱导机体内凝血功能障碍、脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗等途径，促进动脉粥样硬化的发生发展[24]。蛋白聚糖具有调节肿瘤生长及调节新血管生成的功能，在癌症和血管生成中发挥多种功能，调节关键信号通路促进血管生成，推测水蛭通过癌症中的蛋白聚糖通路发挥治疗AMI的作用[25]。主要信号通路包括钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、cGMP-PKG等。钙信号通路可介导心脏细胞收缩-舒张、调节细胞凋亡，在心功能的调节、心肌细胞结构及功能的调节、维持细胞稳态方面发挥着重要的作用[26]。调节神经活性配体-受体相互作用信号通路可维持缺血期及再灌注期心肌线粒体功能，从而发挥心肌的保护与修复作用[27]。血清素能突触又名5-羟色胺能突触，是一种抑制性神经递质，具有调节血管舒张的作用，选择性5-羟色胺激动剂可能有助于预防心肌梗死[28]。血管内皮细胞是心肌缺血再灌注损伤中重要的靶细胞，cGMP-PKG信号通路具有调节血管内皮细胞运动、迁移和增殖的作用，介导内皮依赖的血管舒张、血管新生和血管的通透性，PKG被认为是cGMP-PKG信号通路的重要下游靶点，上调PKG信号通路可拮抗PCI术后血管内皮损伤[29]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对水蛭治疗AMI的作用机制进行初步探讨，结果表明，水蛭可能通过藏红花酸、熊果酸、L-半乳庚酮糖、D-甘露庚酮糖等活性成分，调节INS、ALB、TNF、IL1β等关键基因的表达，进而作用于钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、cGMP-PKG信号通路等发挥治疗AMI的作用，为水蛭的进一步研究及临床应用提供新思路和方向。