STAT5A在弥漫大B细胞淋巴瘤耐药中的意义

吉莉莉，张邢松，何 松，缪小兵

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是淋巴瘤中最常见的亚型，约占非霍奇金淋巴瘤的40%[1]。目前，R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)是DLBCL的一线治疗方案，但仍有相当一部分患者缓解后复发或原发耐药[2]。信号转导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B以及STAT6共7个成员组成。STAT5A表达异常已被证实与多种肿瘤的发生、发展密切相关。本组前期实验发现，STAT5核表达及pSTAT5AY694表达与DLBCL的治疗反应相关；STAT5核阳性、pSTAT5AY694阳性患者比阴性患者的总生存期缩短[3]，但STAT5A在DLBCL中的作用机制仍不清楚。本实验旨在探讨STAT5A在DLBCL耐药中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株人DLBCL细胞OCI-Ly8由复旦大学附属肿瘤医院周晓燕教授惠赠，OCI-Ly10细胞购自南京科佰生物公司。OCI-Ly8、OCI-Ly10细胞分别培养于含10%、20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。

1.2 主要试剂STAT5A抗体(稀释比1 ∶500)购自武汉Proteintech公司(货号13179-1-AP)，GAPDH抗体(稀释比1 ∶5 000)购自武汉Proteintech公司(货号HRP-60004)，Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)抗体(稀释比1 ∶10 000)购自美国Jackson ImmunoResearch Laboratories公司(货号111-035-003)，CCK-8检测试剂盒购自上海东仁公司，多柔比星(Doxo)购自美国Sigma-Aldrich公司，台盼蓝拒染试剂盒购自上海碧云天公司，凋亡抗体芯片(proteome profiler human apoptosis array kit, ARY009)购自美国R&D Systems公司。

1.3 慢病毒感染及筛选STAT5A过表达/干扰慢病毒以及对照慢病毒购自上海吉凯基因公司。慢病毒感染按试剂盒说明书进行。感染完成后，以2 μg/mL的嘌呤霉素对细胞进行筛选，从而获得STAT5A稳定过表达(STAT5AOE)、稳定敲低(shSTAT5A)或对照细胞(Ctrl/shCtrl)。

1.4 Western blot法收集STAT5AOE、shSTAT5A或对照细胞裂解后行SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转印后用含5%脱脂奶粉的PBST封闭2 h，加入STAT5A一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次后使用Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗室温孵育2 h，PBST洗涤3次后ECL液显影。

1.5 CCK-8细胞活性检测将STAT5AOE及对照细胞接种于96孔细胞培养板中(每孔100 μL)，每组设置5个复孔，并设Blank对照(只加培养基不接种细胞)，使用不同浓度Doxo(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L)刺激细胞，刺激完成后每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养1 h，取出培养板，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

1.6 台盼蓝拒染实验将STAT5AOE、shSTAT5A或对照细胞使用1.0 μmol/L Doxo刺激72 h，刺激完成后收集细胞，PBS洗涤并重悬于PBS中；将10 μL细胞悬液与10 μL 0.4%台盼蓝溶液混合，室温孵育1 min。使用血球计数板计数活细胞以及死亡细胞数目，细胞死亡比例(%)=死亡细胞总数/(活细胞总数+死亡细胞总数)×100%。

1.7 凋亡抗体芯片分析依据R&D Systems公司Proteome profiler human apoptosis array kit(ARY009)操作说明书完成抗体芯片检测。

2 结果

2.1 过表达STAT5A对OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞Doxo敏感性的影响Western blot实验结果显示：与对照组(Ctrl)相比，STAT5A蛋白表达水平在STAT5AOE组中显著上调(图1)。CCK-8实验发现：在OCI-Ly8细胞中STAT5AOE组与Ctrl组IC50相比：1.334 μmol/L(95%CI=1.205～1.476)vs0.714 5 μmol/L(95%CI=0.625 8～0.815 8)(图2A)；在OCI-Ly10细胞中STAT5AOE组与Ctrl组IC50相比：1.232 μmol/L(95%CI=1.027～1.478)vs0.780 7 μmol/L(95%CI=0.701 4～0.869 0)(图2B)；提示过表达STAT5A可降低OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞对Doxo的敏感性。台盼蓝拒染实验显示：在OCI-Ly8细胞中Ctrl组与STAT5AOE组细胞死亡比例：(13.0±1.4)%vs(7.9±1.8)%(t=3.89，P=0.018)，Ctrl+Doxo组与STAT5AOE+Doxo组细胞死亡比例：(58.9±1.4)%vs(44.4±5.5)%(t=4.46，P=0.011，图3A)，提示在OCI-Ly8细胞中过表达STAT5A可降低Doxo刺激/未刺激状态下的细胞死亡；与之相似，在OCI-Ly10细胞中Ctrl组与STAT5AOE组细胞死亡比例：(15.7±2.8)%vs(9.7±2.6)%(t=2.94，P=0.042)，Ctrl+Doxo组与STAT5AOE+Doxo组细胞死亡比例：(53.9±3.5)%vs(34.8±4.6)%(t=5.80，P=0.004，图3B)，提示在OCI-Ly10细胞中过表达STAT5A可降低Doxo刺激/未刺激状态下的细胞死亡。上述研究表明，过表达STAT5A可抑制Doxo诱导的细胞死亡，介导细胞耐药性的产生。

图1 Western blot法检测Ctrl以及STAT5AOE细胞中STAT5A蛋白表达水平：A.OCI-Ly8细胞；B.OCI-Ly10细胞

图2 CCK-8法检测Ctrl以及STAT5AOE细胞对多柔比星的敏感性：A.OCI-Ly8细胞；B.OCI-Ly10细胞

图3 台盼蓝拒染法检测过表达STAT5A后弥漫大B细胞瘤细胞对Doxo敏感性的影响：A.OCI-Ly8细胞；B.OCI-Ly10细胞；Untreated.未使用多柔比星刺激；Doxo. 1.0 μmol/L多柔比星刺激；*P<0.05，**P<0.01

2.2 敲低STAT5A后OCI-Ly8、OCI-Ly10细胞对Doxo敏感性的影响Western blot证实：与对照组(shCtrl)相比，STAT5A蛋白表达水平在shSTAT5A组中显著下调(图4)。台盼蓝拒染实验显示：在OCI-Ly8细胞中shCtrl组与shSTAT5A组细胞死亡比例：(12.4±2.0)%vs(17.9±2.6)%(t=2.90，P=0.044)，shCtrl+Doxo组与shSTAT5A+Doxo组细胞死亡比例：(51.8±6.1)%vs(67.7±6.5)%(t=3.10，P=0.036，图5A)；与之相似，在OCI-Ly10细胞中shCtrl组与shSTAT5A组细胞死亡比例：(12.1±1.7)%vs(20.0±4.6)%(t=2.82，P=0.048)，shCtrl+Doxo组与shSTAT5A+Doxo组细胞死亡比例：(53.7±6.2)%vs(68.1±3.2)%(t=3.56，P=0.024，图5B)，提示在OCI-Ly10细胞中敲低STAT5A同样可增加Doxo刺激/未刺激状态下的细胞死亡。上述研究表明，敲低STAT5A可促进Doxo诱导的细胞死亡，增强Doxo的敏感性。

图4 Western blot法检测shCtrl以及shSTAT5A细胞中STAT5A蛋白表达水平：A.OCI-Ly8细胞；B.OCI-Ly10细胞

图5 台盼蓝拒染法检测敲低STAT5A后弥漫大B细胞瘤细胞对Doxo敏感性的影响：A.OCI-Ly8细胞；B.OCI-Ly10细胞；shCtrl.对照细胞；shSTAT5A.STAT5A稳定敲低细胞；Untreated.未使用多柔比星刺激；Doxo.1.0 μmol/L多柔比星刺激；*P<0.05

2.3 STAT5AOE对凋亡相关蛋白表达的影响凋亡抗体芯片分析发现：在OCI-Ly8以及OCI-Ly10细胞中，p53(pS46)[磷酸化p53(Ser46)]、p53(pS392)[磷酸化p53(Ser392)]的表达在STAT5AOE组以及Ctrl组之间差异最明显：STAT5AOE组p53(pS46)、p53(pS392)表达水平比Ctrl组降低(图6)。上述研究提示，在OCI-Ly8以及OCI-Ly10细胞中STAT5AOE可能通过降低p53(pS46)以及p53(pS392)的表达水平抑制细胞凋亡。

图6 凋亡抗体芯片分析Ctrl以及STAT5AOE细胞中凋亡相关蛋白表达水平：A.OCI-Ly8细胞；B.OCI-Ly10细胞；抗体芯片阵列D9、D10代表Phospho-p53(S46)[p53(pS46)]，D11、D12代表Phospho-p53(S392)[p53(pS392)]

3 讨论

DLBCL是一类高度异质性疾病，在生物学行为、组织病理学以及临床特征等多方面存在明显差异。近20年来，R-CHOP是多数未经治疗DLBCL患者的标准治疗方案，但仍有高达40%患者出现难治或完全缓解后复发，这部分患者预后较差。DLBCL耐药的形成包括遗传和(或)表观遗传修饰，浸润性免疫细胞和肿瘤微环境中基质细胞改变肿瘤免疫环境提供凋亡保护等[4]。JAK-STAT信号通路主要由酪氨酸激酶相关受体、Janus激酶(Janus kinase, JAK)和STAT三个部分组成，参与免疫反应、细胞增殖、分化等过程。未被激活的STAT以失活状态存在于胞质中。STAT的激活通常由细胞表面受体上的配体结合启动，随后保守的酪氨酸残基发生激酶依赖性磷酸化，STAT随后以二聚体和(或)四聚体的形式快速转位到细胞核，并调节多种基因的转录[5-6]。STAT5A和STAT5B是STAT5高度同源的两个亚型。STAT5含N端结构域、卷曲螺旋结构域、DNA结合结构域、Src同源2结构域以及C端反式激活结构域等功能域。现已证实，STAT5异常活化与乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生、发展有关[7-8]。有研究表明，STAT5组成性激活在多种血液系统恶性肿瘤的发病中起重要作用，如外周T细胞淋巴瘤[9]、BCR-ABL阳性慢性粒细胞白血病[10]。本组前期研究显示：STAT5核表达以及pSTAT5AY694表达与DLBCL患者的治疗反应有关，其在疾病进展/疾病稳定患者中的表达高于部分缓解/完全缓解患者，且STAT5核阳性、pSTAT5AY694阳性DLBCL患者比阴性患者的总生存期缩短[3]，但STAT5A在DLBCL中的具体作用机制尚不清楚。有文献报道，STAT5A在Doxo耐药细胞系和化疗耐药患者中的表达水平较高，STAT5A通过调节ABCB1的转录促进乳腺癌细胞对Doxo的耐药性；而利用STAT5抑制剂pimozide抑制STAT5A-ABCB1信号通路，可增强耐药乳腺癌细胞对Doxo的敏感性[11]。Kosova等[12]报道，敲低STAT5A表达可增强伊马替尼敏感和耐药慢性粒细胞白血病K562细胞对伊马替尼的敏感性。本实验发现，在OCI-Ly8和OCI-Ly10细胞中STAT5AOE可降低Doxo刺激/未刺激状态下的细胞死亡；而shSTAT5A可增加Doxo刺激/未刺激状态下的细胞死亡，提示过表达STAT5A可抑制Doxo诱导的细胞死亡，介导耐药性的产生。

p53是多种应激状态下调节细胞凋亡的关键因子。p53可通过两种机制诱导细胞凋亡：(1)p53可作为转录因子诱导促凋亡靶基因表达，并抑制抗凋亡靶基因表达；(2)p53转移到线粒体可与BCL-2家族成员相互作用，诱导膜通透性和细胞色素C释放[13]。p53的磷酸化修饰可以发生在p53的多个氨基酸残基上，p53包含38个丝氨酸残基和22个苏氨酸残基。文献报道p53的46位丝氨酸发生磷酸化后获得转录活性，可通过靶向调控p53调节凋亡诱导蛋白1(p53 regulated apoptosis inducing protein 1, p53AIP1)促进细胞色素C的释放，继而诱导细胞凋亡[14]。Castrogiovanni等[13]报道，p53的392位丝氨酸磷酸化可调节p53线粒体易位和转录非依赖性凋亡。本组通过凋亡抗体芯片分析发现，在OCI-Ly8和OCI-Ly10细胞中p53(pS46)、p53(pS392)的表达在STAT5AOE组以及Ctrl组之间差异最明显：STAT5AOE组p53(pS46)以及p53(pS392)表达水平比Ctrl组降低；提示在OCI-Ly8和OCI-Ly10细胞中STAT5AOE可能通过降低p53(pS46)和p53(pS392)的表达抑制细胞凋亡，继而诱导耐药性的产生。

综上所述，STAT5A高表达可降低DLBCL细胞对Doxo的敏感性，STAT5A可能通过降低p53(pS46)以及p53(pS392)的表达水平抑制细胞凋亡，继而诱导耐药性的产生。上述结论是否成立，还需体内实验进一步验证。