84例弥漫大B细胞淋巴瘤组织中MYD88基因突变及其临床意义

胡飘飘，杜 华，李时荣，翁立新，海 玲，乌云嘎，徐晓艳

近年来，随着各种测序技术的迅猛发展，寻找与人弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)发生发展和治疗预后相关的靶基因成为研究热点[1-2]。MYD88基因是一种接头蛋白，可引起多种炎性细胞因子和抗凋亡分子的释放[3]，其发生的致癌基因突变情况常见于Waldenstrom巨球蛋白血症/淋巴浆细胞淋巴瘤、IgM型意义未明的单克隆免疫球蛋白血症、结外边缘区黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等淋巴系统恶性肿瘤中[4-7]。有文献提示MYD88可能与多种B细胞肿瘤有关[8]，这些肿瘤细胞中MYD88 L265P基因突变存在功能性激活，从而促进肿瘤细胞的增殖及进展。近年发现DLBCL中也存在一定比率的MYD88基因突变[9]。因此，本研究检测DLBCL中MYD88 L265P基因突变和MYD88蛋白表达情况，从组织学方面探讨MYD88 L265P基因突变和MYD88蛋白表达与DLBCL发生发展及治疗、预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2009年1月1日～2018年12月31日内蒙古医科大学附属医院病理科明确诊断的84例DLBCL石蜡包埋组织样本及临床病理资料。患者在行淋巴结活检前均未经放、化疗等免疫治疗，且均为原发。其中男性50例，49例≥60岁;结外累及63例；57例血清LDH升高(>240 U/L)；根据Hans分型法进行分型：45例为ABC型，39例为GCB型。对84例患者通过电话方式进行随访，随访日期截至2021年2月，24例失访。

1.2 方法

1.2.1MYD88基因突变检测 按照石蜡包埋组织DNA提取试剂盒里说明书提取DNA。按照2×Taq PCR Master Mix说明书扩增DNA。用得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将合格的样本送到北京博迈德基因公司进行基因突变检测。用Sanger测序法检测MYD88 L265P基因突变情况。DNA提取试剂盒购自天根公司，MYD88 L265P引物购自上海生工公司，2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、核酸染料购自北京博迈德公司。

1.2.2免疫组化 免疫组化染色采用SP法，用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。将石蜡切片放到75 ℃烤片机上烤50 min；依次放入无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇水化；3%过氧化氢封闭10 min；热修复20 min后自然冷却，加一抗后4 ℃过夜，加二抗室温放置50 min；DAB显色，常规脱水、封固。MYD88抗体购自英国Abcam 公司，p53、c-MYC、BCL-2、BCL-6、Ki-67、CD-5、羊抗鼠/兔IgG抗体和DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。

1.3 结果判定用Chromas软件分析测序图，选出基因突变样本。MYD88蛋白免疫组化判读根据阳性细胞百分比计分：≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分；根据阳性细胞着色强度计分：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分，最后进行半定量积分判定。将细胞染色范围与染色强度评分相乘作为最终评分：0～3分为阴性，4～9分为阳性。其余指标的阳性诊断标准为：p53染色细胞数>50%[10]、c-MYC>40%、BCL-2>70%、BCL-6>70%、CD5>30%[11]。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，通过Pearson χ2检验分析MYD88与DLBCL临床病理特征的关系，当理论频数T<5且T≥1时，则采用连续校正的χ2检验；用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，用Logistic回归法对临床病理学特征进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL中MYD88 L265P基因突变情况及与临床病理学特征的关系84例DLBCL患者中有22例检测到MYD88 L265P位点突变(图1)，突变率为26.19%；MYD88 L265P基因突变与Hans分型及MYD88、p53、BCL-2蛋白表达相关(P<0.05，表1)，而与其他指标无明显相关性。

图1 弥漫大B细胞淋巴瘤中MYD88基因L265P位点突变情况：A.MYD88基因L265位点未突变的测序图；B.MYD88基因L265P位点突变的测序图(箭头所示：CTG→CCG)

表1 弥漫大B细胞淋巴瘤中MYD88 L265P基因突变与临床病理学特征的关系[n(%)]

2.2 DLBCL组织中MYD88蛋白表达与临床病理特征的关系MYD88蛋白表达定位于淋巴瘤细胞胞质，84例DLBCL患者中MYD88蛋白阳性33例，阳性率39.29%，MYD88蛋白表达与Hans分型、MYD88 L265P基因突变、BCL-2蛋白表达相关(P<0.05，表2，图2)。

表2 弥漫大B细胞淋巴瘤中MYD88蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

ABCDEFGH

2.3 DLBCL中MYD88基因突变与蛋白表达的相关性Spearman相关分析结果显示：DLBCL中MYD88 L265P基因突变与MYD88蛋白表达呈正相关(r=0.297，P<0.006，表3)。

表3 MYD88 L265P基因突变与MYD88蛋白表达的相关性

2.4 MYD88蛋白表达和基因突变及其他临床病理学因素对DLBCL生存率的影响84例患者中有60例获得随访资料，其中35例死亡，25例健在。

经患者生存曲线分析发现，年龄≥60岁、血清LDH水平升高、MYD88蛋白阳性、MYD88 L265P基因突变型、c-MYC蛋白阳性、BCL-2蛋白阳性组患者的生存率降低，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 弥漫大B细胞淋巴瘤各临床病理特征与患者生存率的关系：A.年龄；B.血清LDH水平；C.MYD88蛋白表达；D.MYD88 L265P基因突变；E.c-MYC蛋白表达；F.BCL-2蛋白表达

2.5 Logistic回归分析DLBCL预后将患者年龄、性别、肿瘤部位、血清LDH水平、Hans分型、MYD88 L265P基因、MYD88、p53、c-MYC、BCL-2、BCL-6、Ki-67、CD5蛋白表达进行Logistic回归分析，结果显示：年龄≥60岁、ABC型、MYD88 L265P基因突变、MYD88、BCL-2蛋白阳性与DLBCL患者的预后有关(P<0.05，表4)。

表4 影响弥漫大B细胞淋巴瘤预后的回归分析

3 讨论

DLBCL是成人淋巴瘤中最常见的亚型，30%～40%的非霍奇金淋巴瘤均为DLBCL，且在我国的发病率呈上升趋势[12]。因此，寻找与DLBCL诊断、治疗和预后相关的靶基因是有意义和必要的。MYD88是接头蛋白，在先天免疫反应和炎症信号传导中起重要作用[13]。近年研究认为MYD88突变与DLBCL相关[8-9]，因此本文对MYD88基因突变及蛋白表达与DLBCL临床病理特征的关系及临床意义进行探索。

本组84例DLBCL中MYD88 L265P基因突变率为26.19%，与大多数研究结果一致[3,14-15]。约29%的ABC型DLBCL具有MYD88 L265P基因突变[4,16-17]。本实验发现MYD88 L265P基因突变率与p53蛋白突变型和BCL-2表达相关，但与患者年龄无相关性。而Lee等[18]认为MYD88 L265P基因突变与患者年龄、预后及免疫分类有关，这与本研究患者年龄的相关性不同，可能与本组样本量较少有关。本实验结果显示，MYD88 L265P基因突变与其蛋白表达呈正相关，但两者阳性率并不完全吻合，造成此结果的原因可能是部分MYD88蛋白表达是由MYD88基因易位、融合、扩增及其他突变点的改变而来。而目前只有针对MYD88 L265P基因突变的靶向药物，因此在临床治疗时仍需做基因检测。本研究结果(MYD88 L265P基因突变与其蛋白表达呈正相关)提示MYD88免疫组化染色可对基因检测起筛选的作用。

本实验发现MYD88蛋白阳性及其基因突变均与BCL-2表达水平相关，BCL-2是一种抗凋亡蛋白，以往研究发现其在多种肿瘤细胞中表达上调，如神经内分泌肿瘤、非黑色素皮肤肿瘤和女性肿瘤等[19-21]，提示MYD88可能通过BCL-2抑制细胞凋亡而促进肿瘤细胞增殖，也可能增强其他癌基因的作用并诱导加速肿瘤生长，促进肿瘤细胞对化学药物的抵抗。MYD88通过BCL-2抑制细胞凋亡的具体机制如何，还需要进一步通过细胞学实验进行研究。有文献报道ABC型DLBCL中MYD88蛋白表达较高[22]，而本实验结果显示ABC型DLBCL中MYD88蛋白阳性率为27.38%，GCB型DLBCL中MYD88蛋白阳性率为11.91%，两者差异有统计学意义，这表明针对MYD88突变DLBCL的靶向药可能为ABC型患者带来一定希望。

有文献报道细胞起源的不同与DLBCL患者生存的差异密切相关[23-24]；DLBCL患者年龄和血清LDH水平对其预后的判断也是有效的指标[25-26]；DLBCL预后不良与BCL-2蛋白阳性相关[27]；BCL-2蛋白和c-MYC蛋白同时阳性时才可以影响患者预后[28-29]。本组结果显示，DLBCL分型、年龄和血清LDH水平可以作为判断其预后的指标，MYD88基因和蛋白水平都与患者预后相关，BCL-2阴性患者的生存率高于阳性患者，而c-MYC与BCL-2对患者生存率的影响相同；回归分析发现，年龄≥60岁、ABC型、MYD88 L265P基因突变、MYD88、BCL-2蛋白阳性与DLBCL患者的预后有关(P<0.05)。因此，用单一指标来判断预后存在争议，可考虑将相关指标联合判断，以提高预后判断的准确性。本实验结果显示：MYD88基因和蛋白水平均与患者的预后密切相关，可为判定DLBCL预后提供依据。

综上所述，临床病理诊断中可适当应用MYD88蛋白表达代替MYD88 L265P基因突变检测，为DLBCL患者靶向治疗提供便利；MYD88 L265P可能通过突变影响MYD88蛋白表达，从而影响DLBCL的发生、发展、治疗及预后，为研究MYD88在淋巴瘤发生发展中的作用机制提供依据。