西凤酒制酒车间环境微生物分布特征研究

徐 晨，白莉圆，张 艳，齐 欢，陈 雪，孟勤燕，张永利，闫宗科

（陕西西凤酒股份有限公司，陕西 凤翔 721406）

空气微生物是指空气中细菌、霉菌和放线菌等有生命的活体，其主要来源是土壤、水体、动植物和人类，另外，污水处理、动物饲养、发酵过程和农业活动等也是空气微生物的重要来源。悬浮于空气中的微生物可形成各种各样的微生物气溶胶，并随气溶胶流动而传播和转移。

我国固态白酒是在相对开放的环境中进行生产的，空气中的微生物是酿造微生物的主要来源之一。在西凤酒传统酿造工艺中，酒醅经甑锅馏酒后，在摊晾、下窖等过程时，空气中大量悬浮的细菌和真菌孢子会以气溶胶形式漂浮在适宜的介质上快速生长，参与白酒发酵，对凤香型白酒香味物质的形成起着至关重要的作用。其次，西凤酒制酒车间空气中的微生物经过多年的富集和驯化，逐步形成了一个复杂并与环境相适应的微生物区系，其微生物数量、种类、分布及其消长变化都会影响西凤酒发酵途径和终产物的生成。若能对西凤酒生产环境中微生物分布状况作深入的研究，无疑对总结凤香型白酒风味的形成机理、有效控制环境条件有着积极的作用。

因此，本课题对西凤酒新老制酒车间空气中真菌、细菌的组成和数量分布情况进行了研究，以期了解新老制酒车间空气微生物差异，并为研究稳定酿酒微生态环境的技术措施提供基础参数。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 研究对象

以陕西西凤酒厂5 个制酒车间（901、902、903、904、905）酿造环境为研究对象，其中901、902、903为老制酒车间，904 和905 为新制酒车间，各车间分别于同一年的每个月采样。

1.1.2 试剂及耗材

PDA 培养基、孟加拉红培养基、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；两性霉素，上海源叶生物科技有限公司；NaCl，天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基配制

葡萄糖马铃薯培养基（PDA，g/L）：马铃薯浸粉3、葡萄糖20、琼脂14，在灭菌后倒平板前，加入两性霉素100 μg/mL。

孟加拉红培养基（g/L）：蛋白胨5、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、葡萄糖10、氯霉素0.1、孟加拉红0.033、琼脂20。

YPD 培养基（g/L）：酵母浸粉10、蛋白胨20、葡萄糖20、琼脂20。

营养肉汤培养基（g/L）：蛋白胨10、牛肉膏3、氯化钠5。

上述培养基均以115 ℃灭菌20 min。

1.1.4 仪器设备

PTX-JA1000 型电子天平，福州华志科学仪器有限公司；YXQ-IS-50A 型立式压力灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-B11 型电热恒温培养箱，SPX-250-Ⅱ型生化培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；FZ20 型pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 采样及计算

采取空气沉降法对制酒车间的空气进行取样，在各车间选取五点，每个点三个平行样。将制作好的培养基平皿放置离地面50～60 cm 处，打开皿盖暴露于空气，以待空气微生物降落在平板表面上。

孟加拉红培养基的培养皿在空气中的暴露时间为1.5 min，取样后以28 ℃±1 ℃培养48～72 h，分别观察记录酵母、霉菌的种群、数量；PDA培养基的培养皿在空气中的暴露时间为2.5 min，取样后以35 ℃±1 ℃培养24～36 h，观察记录细菌的种群、数量。

采用国家标准确定的微生物计算公式计算空气中微生物的浓度，公式如下:

式中：E，单位体积内空气微生物数，cfu/m；A，培养皿的面积，cm；T，培养皿暴露时间，min；N，培养皿中菌落数。

1.2.2 分离纯化

采用平板划线法进行微生物分离，经过反复多次的划线操作得到单菌落。

1.2.3 鉴定方法

将各个菌种纯化后送上海派森诺生物科技有限公司，使用测序仪ABI3730-XL 进行DNA 测序。用NCBI Blast 程序将拼接后的序列文件与NCBI 数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。

1.2.4 统计分析方法

采用SPSS Statistics 26.0 统计软件进行显著性差异分析，采用origin2018绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同季节空气微生物数量分布差异

将取样时间按春季（3—5 月）、夏季（6—8 月）、秋季（9—11 月）和冬季（12—2 月）划分，对各季度3个月的微生物浓度求平均值，得到各制酒车间不同种类空气微生物浓度季节变化情况见图1—图5。

图1 901车间空气微生物浓度季节变化

图2 902车间空气微生物浓度季节变化

图3 903车间空气微生物浓度季节变化

图4 904车间空气微生物浓度季节变化

图5 905车间空气微生物浓度季节变化

由图1 可知，季节变化对901 车间的酵母菌浓度影响较大，不同季节的酵母菌浓度差异显著。霉菌和细菌浓度随季节变化规律基本一致，有下降的趋势，在前三季度变化幅度较小，在冬季有较为明显的下降。其次，除夏季外，其余三个季节酵母菌浓度均远高于霉菌和细菌浓度，且差异显著。全年来看，901车间的酵母菌和细菌浓度都是春季最高，分别为2.96×10cfu/m和9.67×10cfu/m，夏季的酵母菌浓度最低，春季的酵母菌浓度是夏季的21倍。冬季的细菌浓度最低，春季的细菌浓度是冬季的13 倍。霉菌浓度变化幅度小，浓度最高达到6.34×10cfu/m，冬季最低，浓度为7.86×10cfu/m。

由图2 和图3 可知，902 和903 车间不同种类微生物的变化规律基本一致。季节变化对酵母菌浓度影响较大，春季和冬季的酵母菌浓度远高于其余季节，而霉菌和细菌浓度随季节变化不明显。其次，春季和冬季的酵母菌浓度与霉菌和细菌浓度差异显著。全年来看，902 和903 车间春季的酵母菌浓度最高，分别为1.1×10cfu/m和3.87×10cfu/m，夏季的浓度最低，春季酵母菌浓度分别是夏季的30倍和168 倍。两个车间春季的霉菌和细菌浓度较高且全年变化幅度较小，霉菌浓度最高分别达到7.22×10cfu/m和1.1×10cfu/m。细菌浓度最高分别达到1.26×10cfu/m和3.41×10cfu/m。

由图4 和图5 可知，904 和905 车间不同种类微生物的变化规律基本一致。不同于901、902、903三个老车间，两个新车间秋季的酵母菌浓度最高，其次是春季和冬季，不同季节的酵母菌浓度有显著差异。霉菌和细菌浓度随季节变化规律基本一致，有上升的趋势，但幅度很小，各季节之间差异不显著。其次，除夏季外，其余三个季节的酵母菌浓度与霉菌和细菌浓度均差异显著。全年来看，904和905车间秋季的酵母菌浓度最高，分别为2.16×10cfu/m和3.34×10cfu/m，夏季的浓度最低，秋季各新制酒车间酵母菌浓度分别是夏季的61倍和130倍。秋季霉菌浓度最高，分别为1.43×10cfu/m和1.32×10cfu/m，春季和夏季的霉菌浓度趋于一致。细菌浓度则随着季节的变化，逐渐升高，在秋季达到最高，分别为2.14×10cfu/m和2.66×10cfu/m，春季最低，秋季各新制酒车间细菌浓度分别是春季的2.2 倍和3.0倍。

总体来看，各车间空气微生物浓度均为酵母菌＞细菌＞霉菌，但新老车间存在明显差异。老车间以春季微生物数量较多，新车间以秋季数量较多，这可能是由于下半年新制曲车间投产，对新车间的微生物数量影响较大。夏季微生物数量整体偏低。其主要原因是生产过程中，如起糟、拌料、撒曲、翻曲等环节，使附着有微生物（细菌、酵母、霉菌）的糟粒、曲粒悬浮于空气中，从而增加了空气中的微生物数量，而6 月底车间开始停产至8 月底，车间内空气流动少，微生物数量随之减少。建成最早、使用时间最久的老制酒车间901 的微生物浓度季节变化规律与其余4 个车间均不同。老制酒车间902 和903 建成时间一致，地理位置邻近，其微生物季节变化规律也基本一致。同样的，新制酒车间904 和905 在建成时间一致及地理位置邻近的情况下，车间内空气微生物的季节变化规律也基本一致。

2.2 制酒车间可培养空气微生物的种类分布情况

2.2.1 可培养空气真菌分布情况

通过纯化培养后，共挑选出了33 株真菌的单菌落进行鉴定。由表1 可知，33 株菌株属于真菌域的2 个门（Ascomycota 子囊菌门，Mucoromycota 毛霉亚门），5 个科（Aspergillaceae、Saccharomycopsidaceae、Cunninghamellaceae、Lichtheimiaceae、Rhizopodaceae），6 个属（曲霉属、青霉属、复膜孢酵母属、犁头霉属、横梗霉属、根霉属）。多数菌属于Mucoromycota门（22株，66.7%），其中Lichtheimiaceae 为优势科含16 株菌株，其次是Ascomycota 门（11 株，33.3 %），其中Aspergillaceae 为优势科含5 株菌株。陈雪等研究发现西凤酒整个发酵过程中有子囊菌门（Ascomycota）、毛霉亚门（Mucoromycota），其中Ascomycota 占绝对优势。由表2可知，新老制酒车间真菌种类差异不大。

表1 空气中可培养真菌种类

表2 不同制酒车间空气真菌种类分布

从鉴定结果来看，空气中可培养真菌中的优势属为横梗霉属（16 株，48.5 %），其中以伞枝横梗霉和分枝横梗霉数量最多。梗霉属是非常重要的产酯酶菌，许多研究表明，横梗霉是不同香型大曲的优势菌群之一。李良等研究发现一株分枝横梗霉与酿造酒的酒曲混合，能够提高基酒的双乙酰含量，增加香味，以提高出酒率和优品率。从空气中分离出的酵母菌均为扣囊复膜孢酵母，该酵母虽然其产酒精能力不强，但香味浓郁，可使白酒风味更加丰富，同时已有研究表明，扣囊复膜酵母能产α-淀粉酶，能分解生料和熟料淀粉，也能产生糖化酶，将淀粉分解为葡萄糖。复膜酵母菌属是西凤酒酒醅发酵过程中检测出的主要存在的真菌类群。

2.2.2 可培养空气细菌分布情况

通过纯化培养后，共挑选出了117 个单菌落进行鉴定。由表3可知，117株菌株属于细菌域的2个门（Firmicutes 厚壁菌门，Proteobacteria 变形菌门），6 个科（Bacillaceae，Leuconostocaceae，Paenibacillaceae，Staphylococcaceae，Enterobacteriaceae，Erwiniaceae），10 个属（芽孢杆菌属，赖氨酸杆菌属，普里斯特菌属，肠杆菌属，克雷伯氏菌属，莱克雷氏菌属，泛菌属，明串珠菌属，短杆菌属，葡萄球菌属）。多数菌属于Firmicutes 门（78 株，66.7 %），其中Bacillaceae为优势科含74株菌株，其次是Proteobacteria 门（39 株，33.3 %），其中Enterobacteriaceae为优势科含30 株菌株。由表4 可知，新制酒车间空气中的细菌种类比老车间多，老车间在生产过程中经过长期的选择和驯化，在空气中形成了独特且较稳定的微生态区系，新车间不像老车间环境那样对不同种群的微生物具有长期筛选作用，空气的流动性也相对较大，因此，微生物种群数量稍多。

表3 空气中可培养细菌种类

表4 不同制酒车间空气细菌种类分布

从鉴定结果来看，空气中的细菌优势菌属为芽孢杆菌属，尤其是以地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌居多。空气中芽孢杆菌占总细菌数量的63.2%，其中地衣芽孢杆菌占所有芽孢杆菌数量的31 %。中国白酒是注重风味的发酵食品，而产生这些特征风味的核心因素还是微生物的作用，而芽孢杆菌在白酒酿造中对白酒风味的影响自然成为学者研究的重点。芽孢杆菌是白酒发酵过程中极为重要的功能菌属，并且能够有效调节白酒的风味。杨春霞等通过对分离出的芽孢杆菌发酵风味物质进行鉴定后发现，地衣芽孢杆菌产生较多的酯类和含氮化合物，蜡状芽孢杆菌与酯类和醛酮类化合物的合成关系更为紧密，而枯草芽孢杆菌的生成物中主要为杂环类化合物。其中地衣芽孢杆菌是白酒发酵中产酶、产风味能力最强的菌株。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性嗜热杆菌，已经证实这类嗜热芽孢微生物能产乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭尔。其次，据陈雪等的研究可知，芽孢杆菌属是西凤酒发酵入池酒醅细菌群落的重要组成之一，本实验结果与此相符。由于西凤酒生产过程中，酒醅在摊晾等过程中部分的自然接种主要来源于环境空气中的微生物，其中优势菌群的影响更加明显。

3 结论

本试验对西凤酒不同制酒车间春、夏、秋、冬空气中的酵母菌、霉菌、细菌的数量和种类进行研究，得到以下结论：

（1）各制酒车间空气中的三大类微生物数量均呈现酵母菌＞细菌＞霉菌的趋势，每个制酒车间不同季节的酵母菌浓度差异显著，霉菌和细菌差异较小。

（2）901 车间、902 和903 车间、904 和905 车间，以上三者的空气微生物浓度呈现不同的季节变化规律，表明空气微生物浓度受地理位置与车间投产时间先后的影响较大。后续可通过对比各车间的制酒产量及品质，找寻空气微生物与酒质的关系，通过微生物控制来提升品质。

（3）夏季停产前后车间内空气微生物数量差异显著，表明夏季生产进入挑窖及停产阶段后对微生物数量影响较大，空气微生物的数量与空气流动性密切相关。

（4）通过分离纯化、物种鉴定得到117 株细菌和33 株真菌，其中，新制酒车间空气微生物种类比老车间多，表明长期的生产过程对微生物的选择和驯化对环境中稳定的微生态区系的形成至关重要。

本研究分析了西凤酒酿造环境的微生物分布特点，为稳定酿酒微生态环境的技术措施提供基础参数。而这仅仅是第一步，后续还需进一步分析酿造环境空气微生物区系结构与酒醅微生物区系结构的相关性，以及西凤酒不同酿造车间基酒品质的差异与微生物的关系，为深入揭示和阐明凤香型白酒发酵机理提供理论基础。