超声波辅助乙醇提取苦荞酒酒糟及底锅水总黄酮工艺优化

张伟建，袁杰斌，李 茂，赵佳伟，陆 培，安明哲，乔宗伟，赵 东

（宜宾五粮液股份有限公司技术研究中心，四川 宜宾 644007）

苦荞麦属于双子叶蓼科类植物，学名鞑靼荞麦。苦荞麦中营养物质丰富，包含碳水化合物、蛋白质、多酚类、维生素、微量元素等。苦荞麦中黄酮类物质含量高，具有多种生理功能，有降低人体血脂与胆固醇、软化血管、降血压、降血糖、调节肠道菌群、抗氧化等功效，被誉为“药食同源作物”，具有很高的医疗保健价值，且苦荞麦中的黄酮类物质含量要高于其他作物。

苦荞麦作为营养丰富的粮食品种非常适合用于酿酒，由于苦荞中的黄酮类物质具有极高的营养价值，所以苦荞黄酮是苦荞酒中的标志性成分。苦荞酒中苦荞黄酮的含量很低，往往需要通过外源添加苦荞黄酮才能使其含量达到相应的标准，而苦荞黄酮大多是从苦荞麦籽粒中提取，这样会造成粮食资源的浪费。既然苦荞酒中苦荞黄酮的含量低，说明苦荞黄酮残留在副产物中，我国对副产物酒糟的利用除了用于饲料、菌类培养基质外，大部分酒糟直接燃烧丢弃，而底锅水经处理后也会排放。因此，为了保护环境、合理利用资源、避免资源的浪费，从苦荞酒酒糟及底锅水中提取苦荞黄酮的研究具有很高的价值，目前，我国这方面的研究还较少。

超声波辅助提取法利用超声波的机械效应、空化效应及热效应，破坏原料细胞壁，增加溶剂穿透力，促进天然活性物质的析出。超声波技术具有指向性好、能量大、穿透力强等特点。目前超声波辅助提取法已广泛应用到黄酮的提取中，王佰灵等采用超声波辅助酶法提取金荞麦总黄酮，并对其进行抗氧化活性的研究，田晓晶等采用超声波辅助提取法和恒温水浴提取法提取苦荞黄酮，并得出超声波提取法要优于恒温水浴提取法，Peng 等采用超声波辅助法从苦荞中提取了槲皮素、芦丁和山奈酚3 种黄酮类物质，并对提取工艺进行了优化，提取率达到了3.94%。因此，本试验采取超声波辅助乙醇提取法，主要研究了乙醇体积分数、固液比、萃取时间和萃取温度对总黄酮提取的影响，利用正交试验探索超声波辅助乙醇提取法提取苦荞酒酒糟及底锅水混合物中总黄酮的最佳工艺条件，以期提高苦荞酒酿造过程中副产物的利用，提高其附加价值，并为其综合利用提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：苦荞麦市售，酒糟及底锅水为本公司自制。

试剂：九水合硝酸铝、亚硝酸钠（分析纯），购于西陇科学股份有限公司；氢氧化钠（分析纯），购于成都市科隆化学品有限公司；无水乙醇（色谱纯），购于SigmaAldrich（上海）公司。

标准品：芦丁，购于北京世纪奥科生物技术有限公司。

仪器设备：超声清洗器，固特超声；紫外分光光度计EVOLUTION 300，美国Thermo Fisher 公司；电子天平PB203-N，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司（METTLER TOLEDO）；培养箱/干燥箱PH-070A，上海一恒科学仪器有限公司；Mili-Q超纯水系统，美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备

未经蒸煮的苦荞样品：苦荞麦经水洗干净后于60 ℃烘箱中烘干；经蒸煮的苦荞样品：水洗后的苦荞麦经蒸煮后于60 ℃烘箱中烘干；酒糟样品：蒸馏后的酒糟于60 ℃烘箱中烘干；酒糟+底锅水样品：蒸馏后将底锅水与酒糟拌匀，于60 ℃烘箱中烘干。烘干后的样品经粉碎机打成粉状备用。各样品取0.8000 g，精确至0.0001 g，以60%乙醇水溶液为溶剂，料液比为1∶25，在45 ℃条件下超声45 min，萃取完后过滤，并用60%乙醇水溶液洗涤滤渣，收集滤液，最后移至25 mL容量瓶中用60%乙醇水溶液定容至刻度。

1.2.2 芦丁标准曲线的制作

分别吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 的芦丁标准溶液（0.5 mg/mL），于10 mL 的比色管中，分别加3.0 mL、2.8 mL、2.6 mL、2.4 mL、2.2 mL、2.0 mL 无水乙醇，加入5 %亚硝酸钠溶液0.5 mL，混匀后放置6 min，加入10 %硝酸铝溶液0.5 mL，混匀后放置6 min，最后加入4 %氢氧化钠溶液4 mL，用超纯水定容混匀后放置15 min 即得反应混合液。在508 nm 下，以空白样（即标曲的0点）为空白，测定出吸光值。

1.2.3 样品总黄酮含量的测定

吸取样品提取液0.5 mL于10 mL比色管中，再加入2.7 mL无水乙醇，加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，混匀后放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，混匀后放置6 min，最后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，用超纯水定容混匀后放置15 min 即得反应混合液。在508 nm 下，以空白样（即标曲的0 点）为空白，测定出吸光值。

1.2.4 总黄酮含量的计算

式中：X——黄酮类化合物总含量，mg/g；

m——由标准曲线计算出的黄酮质量，mg；

W——样品的质量，g；

d——稀释倍数。

1.2.5 提取工艺优化的单因素试验

1.2.5.1 乙醇体积分数对苦荞酒糟及底锅水总黄酮得率的影响

称取5 份0.8000 g 酒糟及底锅水样品粉末，以固液比1∶25（g∶mL）分别与50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液混匀，在45 ℃下超声45 min 后过滤，滤液移至25 mL 容量瓶中，分别以相同体积分数的乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行试验。

1.2.5.2 萃取温度对苦荞酒糟及底锅水总黄酮得率的影响

称取5 份0.8000 g 酒糟及底锅水样品粉末，以固液比1∶25（g∶mL）与80%乙醇水溶液混匀，分别在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃下超声45 min 后过滤，滤液移至25 mL 容量瓶中，用80%的乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行试验。

1.2.5.3 萃取时间对苦荞酒糟及底锅水总黄酮得率的影响

称取5 份0.8000 g 酒糟及底锅水样品粉末，以固液比1∶25（g∶mL）与80 %乙醇水溶液混匀，在45 ℃下分别超声25 min、35 min、45 min、55 min、65 min 后过滤，滤液移至25 mL 容量瓶中，用80 %的乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行试验。

1.2.5.4 料液比对苦荞酒糟及底锅水总黄酮得率的影响

称取5 份0.4000 g 酒糟及底锅水样品粉末，分别以固液比1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55（g∶mL）与80%乙醇水溶液混匀，在45 ℃下超声45 min 后过滤，滤液移至25 mL 容量瓶中，用80%乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行试验。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

采用NaNO-Al(NO)比色法测定芦丁含量，以芦丁浓度为纵坐标，OD为横坐标，绘制标准曲线，结果见图1。

图1 芦丁标准曲线

由图1 可知，芦丁标准曲线为：y=0.0883x+0.0005，相关系数R=0.9998，说明二者线性关系相当好。

2.2 不同样品间总黄酮含量的差异

从图2 能清晰地看出，总黄酮含量从高到低分别为酒糟+底锅水、酒糟、未经蒸煮的苦荞、蒸煮后的苦荞。其中，酒糟和酒糟+底锅水样品中的总黄酮含量要远高于未经蒸煮的苦荞和蒸煮之后的苦荞，酒糟中总黄酮含量是前两者的1.6～1.9 倍，酒糟+底锅水中总黄酮含量是前两者的2.6～3.1 倍，这可能是因为在苦荞酒发酵过程中，通过微生物代谢，使得苦荞麦质地变得松软，更易与萃取剂结合，从而使得总黄酮含量增加。酒糟+底锅水中的总黄酮含量要远高于酒糟中的黄酮，是酒糟中总黄酮含量的1.6 倍，可能是因为在酒醅的蒸馏过程中，乙醇和水不断被蒸馏后又冷凝下来，形成了类似回流的过程，使苦荞中部分黄酮类物质流失到甑桶的底部，从而导致底锅水中含有大量的黄酮类物质。通过分析未经蒸煮的苦荞和经蒸煮之后的苦荞样品能进一步证明，未经蒸煮的苦荞中总黄酮含量是蒸煮后苦荞的1.1 倍，蒸煮过程中通过水的不断蒸发与冷凝，使苦荞中部分黄酮类物质流失到锅内水中。由此判断，应该利用蒸酒之后的酒糟以及产生的底锅水用来提取黄酮类物质，不仅节省原料，同时增加了酒糟以及产生的废水利用率。后续提取工艺的优化均以酒糟+底锅水混合样品为实验对象。

图2 不同样品间总黄酮含量

2.3 苦荞酒酒糟及底锅水混合物黄酮提取工艺单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

由图3可知，乙醇体积分数小于80%时，总黄酮含量随着乙醇体积分数的增加而增加；当乙醇体积分数为80%时总黄酮含量最高，达到41.25 mg/g；当乙醇体积分数大于80 %时，总黄酮含量随之下降。由于乙醇体积分数为70%、80%、90%时提取的黄酮总含量差异较大，因此，后续做正交试验时，乙醇体积分数选择75 %、80 %、85 %作为三个水平。

图3 乙醇体积分数对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

2.3.2 萃取温度对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

由图4 可知，萃取温度在35～45 ℃时，萃取出来的总黄酮含量呈上升趋势，当萃取温度为45 ℃时提取的总黄酮含量最高，达到43.60 mg/g；当萃取温度大于45 ℃时，总黄酮含量随之降低。因此，后续做正交试验优化提取工艺时，萃取温度选择40 ℃、45 ℃和50 ℃作为三个水平。

图4 萃取温度对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

2.3.3 萃取时间对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

由图5 可知，当萃取时间小于45 min 时，总黄酮含量随萃取时间的延长迅速增加，当萃取时间为45 min 时，所提取的总黄酮含量达到最大值，达到了50.64 mg/g，随后当萃取时间再度延长时，总黄酮含量随时间的延长而缓慢下降。因此，后续做正交试验优化提取工艺时，萃取时间选择35 min、45 min和55 min作为三个水平。

图5 萃取时间对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

2.3.4 固液比对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

由图6可知，当固液比在1∶15～1∶45之间时，所提取的总黄酮含量随固液比的增加而增加，总黄酮含量在固液比为1∶45时达到最大值，为48.92 mg/g。当固液比再度增加时，总黄酮含量开始呈现下降趋势。因此，在后续做正交试验优化萃取工艺时，固液比选择1∶35、1∶45和1∶55作为三个水平。

图6 固液比对苦荞酒酒糟及底锅水混合物总黄酮含量的影响

2.4 酒糟和底锅水混合物黄酮提取工艺正交试验（见表1、表2）

表1 L9(34)正交试验因素水平表

由表2 可知，苦荞酒酒糟及底锅水总黄酮的最佳提取条件为ABCD，由极差值R 可知，各因素对苦荞黄酮的影响次序为：B（乙醇体积分数）＞C（固液比）＞A（萃取时间）＞D（萃取温度）。

表2 苦荞酒酒糟及底锅水混合物提取的正交试验结果与分析

3 结论

酒糟和底锅水样品中总黄酮含量要远高于酒糟、未经蒸煮的苦荞和蒸煮之后的苦荞。由正交试验结果分析可知，超声波辅助乙醇提取苦荞酒酒糟及底锅水中苦荞黄酮的最佳条件为：乙醇体积分数为85 %、萃取温度为40 ℃、萃取时间55 min、固液比1∶45（g∶mL）。影响程度为：乙醇体积分数＞固液比＞萃取时间＞萃取温度。本文研究成果不仅对保护环境、合理利用资源有利，也为以后苦荞黄酮的提取提供了参考。