响应面法优化云霄产枇杷叶三萜酸类成分的提取工艺△

高伟城，王小平*，黄建军，王二丽，谢伟容，黄醒梅，林小晴，陈羽晴

1.漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000；2.漳州市医院，福建 漳州 363000

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥叶[1]，具有祛痰、止咳、抗炎、抗肺纤维化等功效[2]，临床应用广泛。以“咳嗽”和“枇杷叶”为关键词在中国中医药数据库（http://cintmed.cintcm.com/cintmed/）中进行检索，有70 首方剂。其中，三萜酸类成分是其重要药效成分[3]，主要为熊果酸、齐墩果酸及以其为母体的衍生物[4]。

福建省云霄县有“中国枇杷之乡”的称号，枇杷种植面积达0.93 万hm2，而果农常把枇杷叶当作柴火烧掉或不处理。若能进行资源再利用，不仅可以给当地农民增收，也可为云霄区域经济发展带来新动力[5-6]。

本研究对云霄枇杷叶三萜酸类成分进行提取工艺研究，以期对枇杷叶进行资源开发利用，为进一步研究开发枇杷叶相关产品提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪；TU-1901 型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Mettler-Toledo XSE205DU 型电子分析天平、OHAUS PX224ZH/E 型电子分析天平（奥豪斯仪器常州有限公司）；FST-Ⅲ-10 型精密超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）；XL-10B型中药粉碎机（广州旭朗机械设备有限公司）；CW-2000A 型超声-微波协同萃取反应仪（上海新拓分析仪器科技有限公司）；KQ5200 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZKF040 型真空干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）；HWS-28 型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品熊果酸（批号：MUST-19062710，纯度≥98.46%）、齐墩果酸（批号：MUST-19032706，纯度≥98.46%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯；香草醛、乙酸铵（西陇科学股份有限公司，分析纯）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司，分析纯）；乙醇（食用级）。

枇杷叶（早钟，批号：20201015）采自云霄县火田镇，2020 年10 月采收。经漳州卫生职业学院中药教研室王小平教授鉴定为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 枇杷叶预处理

将新鲜采收的枇杷叶用沸水潬3 min左右，取出晾干，再用鼓风干燥箱70 ℃烘干，备用。

2.2 枇杷叶干浸膏制备

将枇杷叶切成宽丝（9～10 mm），称取50 g，以适宜的乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取次数进行回流提取，浓缩提取液，真空减压干燥，即得，备用。

2.3 考察指标

以干浸膏得率、总三萜酸含量、齐墩果酸及熊果酸的含量为评价参数，设置权重系数分别为20%、40%、40%，进行无量纲化加权处理，得综合评价值。

2.4 总三萜酸含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品5.22 mg，置于50 mL 量瓶中，用甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为104.4 μg·mL-1的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 称取干浸膏0.01 g，加甲醇超声溶解并定容至25 mL，即得，备用。

2.4.3 测定波长的选择 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1 mL于10 mL具塞试管中，90 ℃水浴将溶剂蒸干，加入新配制5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，再加入的高氯酸0.8 mL，充分摇匀，在60 ℃的水浴中加热15 min，立即取出，放入冷水中冷却至室温，再加入冰醋酸5 mL，摇匀。在400～800 nm 波长进行扫描，以甲醇试剂作参比。结果表明，供试品溶液和对照品溶液在550 nm 处均有最大吸收，空白干扰最小，故选550 nm作为测定波长。

2.4.4 标准曲线的绘制 准确吸取熊果酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，90 ℃水浴加热蒸干溶剂，依次加入新配制5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，充分摇匀，在60 ℃的水浴中加热15 min，立即取出，放入冷水中冷却至室温，再加入冰醋酸5 mL，摇匀。以0 mL 作空白对照，在550 nm 波长处测定吸光度（A）[7]。以A为纵坐标（Y），熊果酸质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。Y=0.050 1X-0.020 4，r=0.999 1，结果表明，熊果酸在3.48～17.4 μg·mL-1线性关系良好。

2.4.5 精密度试验 准确吸取熊果酸对照品溶液1 mL，按照2.4.4项下方法连续测定6次，测得A的RSD为0.45%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 重复性试验 准确吸取6份枇杷叶宽丝（9～10 mm）各50 g，按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液1 mL，按照2.4.4 项下方法测定，测得含量的RSD 为1.29%，表明该方法重复性良好。

2.4.7 稳定性试验 准确吸取6 份供试品溶液1 mL，于室温放置0、2、4、8、16、24 h，按照2.4.4 项下方法测定A，测得A的RSD 为1.19%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.8 加样回收率试验 准确称取6 份枇杷叶宽丝（9～10 mm）各25 g，按照2.4.2 项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液1 mL 置具塞试管中，再分别加入熊果酸对照品溶液0.5 mL，按照2.4.4 项下方法测定，平均加样回收率为98.62%，RSD为1.76%。

2.4.9 样品溶液测定 精密吸取供试品溶液1 mL，按照2.4.4 项下方法进行测定，按公式（1）计算总三萜酸质量分数（K）。

式中，C为供试品溶液质量浓度，L为称取干浸膏的质量，M为总干浸膏质量。

2.5 齐墩果酸和熊果酸的含量测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack Scepter HDC18-80（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸铵溶液（67∶12∶21）；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温：40 ℃。色谱图见图1。

图1 枇杷叶供试品溶液与混合对照品溶液的HPLC图

2.5.2 混合对照品溶液的制备 精密称取熊果酸、齐墩果酸对照品适量，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成熊果酸492.5 μg·mL-1、齐墩果酸125 μg·mL-1的混合对照品储备溶液，备用。

2.5.3 供试品溶液的制备 称取干浸膏0.09 g，加甲醇超声溶解并定容至25 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1、2、3、4、5、10 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，分别精密吸取20 μL，按2.5.1 项下色谱条件测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果熊果酸线性回归方程：Y=668.26X+92.065，r=0.999 6，在0.985～4.925 μg 峰面积与进样量呈良好线性关系，齐墩果酸线性回归方程：Y=722.07X+75.524，r=0.999 5，在0.25～1.25 μg 峰面积与进样量呈良好线性关系。

2.5.5 精密度试验 精密吸取同一质量浓度的混合对照品溶液20 μL，重复进样测定6次，计算熊果酸的峰面积RSD 为1.07%，齐墩果酸的峰面积RSD 为1.01%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 精密称取同批次枇杷叶（批号：20201015）50 g，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，于室温放置0、2、4、8、16、24 h 后分别取样测定，结果熊果酸的峰面积RSD 为1.62%，齐墩果酸的峰面积RSD 为1.16%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.7 重复性试验 精密称取6 份同批次枇杷叶（批号：20201015）50 g，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果齐墩果酸、熊果酸的平均质量分数分别为1.997（RSD为1.06%）、7.667 mg·g－1（RSD为1.75%）。

2.5.8 加样回收率试验 精密称取6 份已知含量的枇杷叶25 g，每份分别精密加入123.13 μg·mL-1的熊果酸、31.25 μg·mL-1的齐墩果酸对照品溶液1 mL，按2.5.3 项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果熊果酸平均回收率为99.61%，RSD 为1.22%；齐墩果酸平均回收率为99.11%，RSD为1.92%。

2.5.9 样品含量测定 精密移取2.5.3 项下供试品溶液，按2.5.1 项下色谱条件进样，每个样品平行测定3 次，采用外标法计算样品中熊果酸、齐墩果酸的平均质量分数。

2.6 提取方法筛选

查阅相关文献[3,8-9]，本实验对比了回流提取法、超声提取法和超声微波协同提取法，共同方法为50 g枇杷叶，80%乙醇，液料比10∶1，提取3 次。结果表明，在不同提取条件下，前2次提取得到的枇杷叶干浸膏得率、总三萜含量、齐墩果酸及熊果酸含量可达到90%以上；超声提取与超声微波协同提取两者提取效果相当，相对来说超声微波协同提取更省时，而回流提取效果在3 个方法中最好（表1）。从经济性、安全性角度，回流提取更符合工业化生产实际。

表1 枇杷叶提取工艺提取方法的筛选

2.7 单因素试验

按照表2 的设计条件每组进行回流提取，考察各因素下干浸膏得率、总三萜酸含量、齐墩果酸和熊果酸含量的变化影响。见图2。

图2 枇杷叶提取工艺单因素的试验结果

表2 枇杷叶提取工艺单因素试验设计

结果表明，随着乙醇体积分数的提升，干浸膏得率、总三萜酸含量、齐墩果酸和熊果酸含量有明显的增加，其中乙醇体积分数为65%～80%时增加显著，80%～95%时增加稍缓和，这与三萜类成分极性低相符合。当液料比为14∶1 时，干浸膏得率、总三萜含量、齐墩果酸和熊果酸含量开始有明显增加。饮片切丝宽度，对干浸膏得率、总三萜含量、齐墩果酸和熊果酸含量影响较小。随着提取时间延长，干浸膏得率、总三萜含量、齐墩果酸和熊果酸含量有缓慢增加趋势。

2.8 Box-Behnken响应面法试验

2.8.1 响应面法设计 根据单因素试验结果，采用Design-Expert 8.0.6 软件设计四因素三水平试验方案，见表3。选择中心点重复试验5次，得交互作用试验29 组，以干浸膏得率、总三萜酸含量、齐墩果酸及熊果酸的含量进行无量纲化处理得到的综合评价值为考察指标，进行试验，结果见表4。

表3 枇杷叶提取工艺响应面试验因素水平

表4 枇杷叶提取工艺响应面试验设计及结果

2.8.2 模型建立及其显著性检验 通过Design-Expert 8.0.6 软件分析，得到二次多元回归方程：Y=0.87-0.026A+0.021B+0.032C+0.065D+0.020AB-0.029AC -0.042AD+0.012BC -4.250×10-3BD+0.019CD+4.792×10-3A2-0.011B2-0.030C2-0.068D2。方差分析结果见表5，结果表明，模型的P＜0.001，回归模型极显著；失拟项P＞0.05，显示非试验因素对试验结果影响不大；决定系数0.921 6＞0.6，模型拟合较高；变异系数为3.35%，试验精确度良好；信噪比（S/N）为12.402＞4，表明可用模型对三萜酸的提取进行分析和预测。由回归模型显著性分析可知，B 和C2显著（P＜0.05），A、C 和AD 非常显著（P＜0.01），D 和D2极显著（P＜0.001)，其余项均不显著。4 个因素对三萜酸的提取影响顺序为D＞C＞A＞B。

表5 枇杷叶提取工艺响应面试验方差分析结果

2.8.3 两两因素交互作用分析 枇杷叶提取两两因素之间交互作用的响应面3D图与等高线图，见图3。可以看出，提取次数和乙醇体积分数2 个因素的交互影响作用最强，随着提取次数增加，综合评价值明显升高，且等高线呈椭圆形。其次是提取时间与乙醇体积分数，液料比与提取次数影响最小。

图3 枇杷叶提取工艺响应面试验各因素交互作用对综合评价的响应面图和等高线图

2.8.4 提取条件的优化及模型验证结果 由响应面法得出的枇杷叶三萜酸的最佳提取工艺条件为95%乙醇，液料比16∶1，提取时间2.31 h，提取数2.18次，理论综合评价值为0.881。考虑实际操作，将最佳工艺条件修正为95%乙醇，液料比16∶1，提取时间2 h，提取数2 次，在此条件下平行试验3 次，得枇杷叶干浸膏得率为23.60%，总三萜酸质量分数为5.71%，齐墩果酸与熊果酸的总质量分数为0.94%［《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定不低于0.7%］，综合评价值的平均值为0.838（RSD 为2.54%），比模型综合评价值低0.043，这与实际修正提取时间、提取次数有关，因两者对结果有显著影响，表明Design-Expert 8.0.6 建立的模型的预测具有良好的准确率，可以很好地优化枇杷叶中三萜酸类成分的提取工艺。

3 讨论

3.1 提取方法筛选

本实验比较了回流提取、超声提取及超声微波协同提取，结果表明，超声提取和超声微波协同提取效果相当，超声微波提取更省时，回流提取效果更好。回流提取符合环境友好的理念，操作简单、经济安全、大规模化生产投资较少，而且为后续纯化工艺带来了便捷[8]。

3.2 测定波长、流动相和色谱柱选择

齐墩果酸与熊果酸两者是同分异构体，分离难，在查文献、借鉴前人的研究结果基础上[3,9-12]，分别对190、208、210 nm 进行检测波长筛选，最终确定210 nm，该波长下齐墩果酸与熊果酸吸收峰峰形较好。分别对乙腈-甲醇-0.5%乙酸铵溶液、乙腈-水、甲醇-水及乙腈-磷酸水的不同比例进行考察，也考察了不同型号的色谱柱如Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），最后选择Shim-pack Scepter HDC18-80 色谱柱，乙腈-甲醇-0.5%乙酸铵溶液，可以将两者较好分离。

3.3 饮片切制宽度

中药饮片切丝，适用于皮类、叶类和较薄的果皮类等药材。《中国药典》2020年版（四部）0213炮制通则，饮片切丝，细丝2～3 mm，宽丝5～10 mm。本实验考察了细丝与宽丝对三萜酸的提取率影响，结果表明，细丝与宽丝对三萜酸的提取率影响差异无统计学意义，与市场上枇杷叶饮片切制规格宽丝（9～10 mm）相符合。

3.4 提取条件的优化

查阅有关枇杷叶三萜酸提取工艺的文献[3,8]，有14.4 倍量82%乙醇，提取2 次，每次155 min，三萜酸提取率为3.38%，本实验三萜酸提取率为5.71%，获得较高的三萜酸提取率。但乙醇体积分数高，液料比为16∶1，溶剂用量相对大一些，也相应增加工业生产安全性风险及成本。