过表达环状RNA circTCF25经miR-128靶向VEGF-C对膀胱癌细胞生物学行为的影响

陈旭轮,王 帅,宋明欣,张丹丹,王丽丽,宋 歌,迟宝进

(佳木斯大学附属第一医院 泌尿外科,黑龙江 佳木斯154000)

膀胱癌是泌尿系统较常见的恶性肿瘤，调查显示，在世界范围内，膀胱癌的发病率居全身恶性肿瘤的第九位，且其发病率表现为逐年升高的趋势，严重威胁着人类的生命健康[1-2]。目前临床上对膀胱癌的具体发病机制尚不完全明确，且缺乏有效治疗此病的手段，因此尽早发现和阻止疾病进展、转移、复发对挽救患者生命，延长生存周期具有重要的意义[3]。目前临床上一直致力于治疗膀胱癌靶点的研究，环状RNA(cirRNAs)是近年来所发现的具有闭合环状结构的RNA分子，其结构较为稳定，在序列上具有高度保守性，广泛存在于真核细胞中，研究发现，环状RNA可作为miRNA的“分子海绵”抑制其功能[4]。但目前关于环状RNA参与恶性肿瘤的机制尚不完全明确，且在膀胱癌中的研究较少，基于此背景，在本文研究中分析过表达环状RNA circTCF25对膀胱癌细胞生物学行为的影响，明确环状RNA circTCF25是否与膀胱癌相关，是否可作为膀胱癌的治疗靶点，以期望造福于更多的患者。

1 材料与方法

1.1 材料

取于佳木斯大学附属第一医院病理科保存的未经放化疗治疗且经临床确诊的20例膀胱癌患者膀胱癌组织及癌旁组织。另外购买膀胱癌细胞株T24(上海冠导生物工程有限公司，货号：GD-C219508)，备用。

主要试剂：环状RNA circTCF25过表达载体(广州吉赛生物技术有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司)；psiCHECK2双荧光素酶报告基因(上海海吉浩格生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1miR-128、VEGF-C检测 取膀胱癌组织、癌旁组织，采用实时荧光定量PCR法测定膀胱癌组织、癌旁组织中miR-128、VEGF-C表达量，采用2-△△Ct方法计算出miR-128、VEGF-C表达量。

1.2.2环状RNA circTCF25转染 构建环状RNA circTCF25过表达载体(pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP)，将上游环框架(包含EcoRI酶切位点、内源侧翼基因组序列)、下游环框架(包含BamHI酶切位点、部分倒置的上游序列)插入，扩增circTCF25序列，连接至上下游环框架间。另外构建不含环状RNA circTCF25的空载体。对膀胱癌细胞T24进行培养，使用转染试剂Lipofectamine 2000按照做细胞转染，分为空载组(转染不含环状RNA circTCF25的空载体)、过表达组(转染环状RNA circTCF25过表达载体)，转染48h后行后续试验。采用实时荧光定量PCR法鉴定膀胱癌细胞做环状RNA circTCF25过表达和空载转染结果。

1.2.3双荧光素酶报告基因实验 将circTCF25序列克隆至psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体上，命名为WT-psiCHECK2-circTCF25，同时合成具有miR-128结合位点的突变circTCF25序列，重复上述克隆步骤，命名为Mut-psiCHECK2-circTCF25。将包含有miR-128结合位点的VEGF-C-3’UTR克隆至psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体上，命名为WT-psiCHECK2-VEGF-C-3’UTR，同时合成具有miR-128结合位点的突变VEGF-C-3’UTR序列，重复上述克隆步骤，命名为Mut-psiCHECK2-VEGF-C-3’UTR。Rluc为报告基因，Fluc为内参基因，参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书做细胞分组转染处理，参照Rluc/Fluc为相对荧光素酶活性，Rluc为海肾荧光素酶基因发光值，Fluc为萤火虫荧光素酶基因发光值，根据双荧光素酶报告基因实验分析环状RNA circTCF25是否靶向结合miR-128、miR-128是否靶向结合VEGF-C。

1.2.4细胞生物学行为情况检测 将空载组、过表达组细胞以每孔3×105个接种至6孔板中，分别在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h行锥虫蓝染色，以时间为横轴，细胞数目为纵轴做细胞生长曲线，分析细胞生长情况。增殖活性采用MTT法测定，将空载组、过表达组细胞接种于96孔板中，每孔中加入200 μl的细胞悬液、10 μl MTT试剂，使用酶标仪测定A值，评价细胞增殖活性。克隆形成能力使用平板克隆实验测定，空载组、过表达组细胞以每个平皿加入200个细胞种植于六孔板中，在细胞培养箱中培养14 d后做漂洗染色处理，之后做常规克隆计数。细胞迁移能力使用划痕实验测定，将所培养的细胞在18孔板上进行接种，待细胞生长至80 %时，使用枪头(100 μl)做垂直划直线操作，之后使用PBS洗涤3次，加入血清培养基(0.5%)，24 h、48 h后使用倒置显微镜观察细胞迁移情况。细胞侵袭能力使用Transwell小室测定，Transwell小室中放置所培养的细胞，其中下室接种100 ng/mL IL-8、上室接种细胞悬液，1 d后下室加TMP溶液TMP溶液孵育，孵育时间大约为180 min，之后使用洁净无菌棉签将上室微孔中的细胞擦除，PBS洗涤，洗涤操作完成后在4%多聚甲醛溶液中固定15 min，苏木晶染色、PBS清晰，使用倒置显微镜观察细胞侵袭情况。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-128、VEGF-C在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达分析

如表1所示，膀胱癌组织中miR-128表达量低于癌旁组织，VEGF-C表达量、阳性表达率高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 miR-128、VEGF-C在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达分析

2.2 环状RNA circTCF25转染效率鉴定

如表2所示，过表达组环状RNA circTCF25表达量高于空载组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 环状RNA circTCF25转染效率鉴定

2.3 过表达环状RNA circTCF25对miR-128、VEGF-C表达的影响

如表3所示，过表达组miR-128表达量低于空载组，VEGF-C表达量高于空载组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 过表达环状RNA circTCF25对miR-128、VEGF-C表达的影响

2.4 双荧光素酶报告基因结果分析

双荧光素酶报告基因显示，环状RNA circTCF25靶向结合miR-128，miR-128靶向结合VEGF-C。

2.5 过表达环状RNA circTCF25对膀胱癌细胞生长、增殖活性、克隆形成能力的影响

如表4所示，过表达组细胞生长数、增殖活性、克隆形成能力均高于空载组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 过表达环状RNA circTCF25对膀胱癌细胞生长、增殖活性、克隆形成能力的影响

2.6 过表达环状RNA circTCF25对膀胱癌细胞迁移、侵袭的影响

如表5所示，过表达组细胞迁移、侵袭能力均高于空载组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表5 过表达环状RNA circTCF25对膀胱癌细胞迁移、侵袭的影响

3 讨论

临床认为，在多种因素的共同作用下抗癌基因失活和癌基因激活，进而促进肿瘤细胞生长，导致生长、凋亡失衡，最终促进疾病进一步进展[5-6]。

cirRNAs属于一类首尾共价结合的呈环状的RNA分子，曾一直被认为是错误剪接的副产物，但随着目前高通量测序和生物信息学分析技术的不断发展，cirRNAs已经逐渐成为非编码RNA研究领域的热点[7-9]。近期有研究发现，cirRNAs可作为miRNA“分子海绵”而发挥作用，与其他同源性RNA形成竞争，参与疾病的发生进展[10]。临床多数研究已经证实[11-12]，cirRNAs与miRNA密切相关。另有研究发现[13]，环状RNA circTCF25属于cirRNAs的一种，其在临床上已经被证实在膀胱癌组织中表达升高，过表达环状RNA circTCF25可通过miR-103a-3p/miR-107调控CDK6的表达促进膀胱癌的增殖和迁移。上述研究提示着环状RNA circTCF25与miRNA相关，本文中经双荧光素酶报告基因分析验证了环状RNA circTCF25与miR-128之间的直接靶向关系。

miR-128在临床上被认为是一种具有双面性的miRNA，通常情况下其发挥抑癌基因的作用，同时具有调节细胞增殖、迁移、侵袭、耐药等作用[14-16]。目前关于miR-128在膀胱癌中的表达研究较少，但已经证实其在膀胱癌组织中表达降低，在膀胱癌组织中发挥着抑癌基因的作用[17-18]。VEGF-C在临床上被认为与淋巴管生成、血管生成相关，认为其具有调控细胞增殖、调往的作用，临床已经有研究发现，VEGF-C属于miR-128的靶基因，在人类恶性肿瘤的形成中miR-128靶向VEGF-C具有重要的作用[19-21]。本文研究中经双荧光素酶报告基因分析验证了miR-128与VEGF-C之间的直接靶向关系。本文结果发现，环状RNA circTCF25与miR-128、miR-128与VEGF-C之间的直接靶向关系，结果显示，过表达环状RNA circTCF25后其表达降低程度更显著，且经过表达环状RNA circTCF25后膀胱癌细胞生长、迁移、侵袭能力明显提升，miR-128表达降低，VEGF-C表达升高，此结果提示着过表达环状RNA circTCF25可能经miR-128靶向VEGF-C影响膀胱癌细胞生物学行为。

综上所述，本文研究发现，过表达环状RNA circTCF25可能经miR-128靶向VEGF-C发挥促进膀胱癌细胞生长、增殖活性、克隆形成能力、迁移、侵袭的作用，此结果提示，环状RNA circTCF25可作为膀胱癌临床治疗的一个新靶点，以阻碍肿瘤进展。