枫杨砧木与核桃嫁接接合部愈合过程的解剖学研究

王春梅，沈 珊，王 红，李景军，张秋明，曹尚银

(1 岳阳职业技术学院，湖南岳阳，414000；2 湖南农业大学，长沙，410128；3 中国农业科学院郑州果树研究所，郑州，450009)

核桃(Juglansregia)为胡桃科核桃属植物，是世界四大干果之首[1]，具有极高营养价值和经济效益，是重要的经济树种。全世界核桃分布和栽培遍及北美洲、亚洲、欧洲、大洋洲、南美洲等50多个国家和地区，核桃已是许多国家的重要经济树种[2]。从2003年起，我国每年核桃产量增长量近15%，成为第二大油料作物[3]。目前，中国已成为世界上最大核桃生产国，产量占世界50%以上[4]。

嫁接是核桃良种化栽培的重要途径[2]。其中核桃砧木对嫁接品种的适应性、抗逆性及品质、产量等具有重要影响[5]。目前，核桃主产国核桃产业也均因砧木相关病害受到制约[6-7]，如美国加州的核桃种植者面临着与砧木相关的一系列严重病虫害问题，包括穿刺短体线虫、冠瘿病、疫病等[8]，许多国家正大力进行核桃砧木良种的选育研究[9-11]。美国加州大学戴维斯分校已培育出能抗一种或多种此类疾病的无性系核桃砧木[8]。目前世界常用核桃砧木主要有核桃属的奇异核桃(J.paradox)、黑核桃(J.hindsii)、普通核桃(J.regia)和铁核桃(J.sigillata)等[2]。我国也开始进行核桃砧木选育，并选取出一些品种。山西省林业科学院从山西省屯留县核桃实验站选育出晋RS系核桃砧木优系，中国林业科学研究院采用核桃(J.regia)与美国加州魁核桃(J.major)进行杂交，选育出“中宁强”和“中宁奇”核桃砧木新品种[12-14]。近年，国内外尝试采用枫杨(Pterocaryastenoptera)作为核桃砧木。枫杨是胡桃科枫杨属植物，其根系特别发达，且具有较强的耐热性、耐涝性，有一定的抗旱性，对疫霉属致病菌和根际线虫造成的病害具有抗性[2]。美国的Browne等[15]研究发现，与奇异核桃杂种(J.hindsii×J.regia)和北加州黑核桃(J.hindsii)相比较，7个无性系枫杨对疫霉菌(Phytophthoracinnamomi和P.citricola)具有相对抗性，在被P.cinnamomi和P.citricola污染的土壤上枫杨可能是有用的核桃砧木，但枫杨做砧木与部分核桃品种嫁接存在不亲和的现象。

嫁接成活过程的关键是砧穗愈合过程，其实质是砧木和接穗的相互作用，通过愈伤组织的形成、连接，维管束分化、连通，组合成有机整体，期间组织结构进行着系列变化。因此，其细胞学和组织学变化是观察嫁接愈合过程的关键，也是研究其嫁接亲和力的重要内容[16-19]。黄坚钦等[20]对以胡桃科的山核桃Caryacathayensis、化香树Platycaryastrobilacea为砧木的山核桃嫁接愈合过程进行了解剖学观察，发现山核桃嫁接经过了愈伤组织形成、对接、维管束桥的形成及维管分化等过程，搞清了每个过程形成的关键时期。周乃富等[21]对核桃J.regia种内芽接愈合过程的组织学进行观察，研究了不同嫁接时期砧穗在愈伤组织形成、增殖和输导组织连接过程中的组织学变化机制。陈岗等[22]通过荧光参数等生理指标的测定和分析对美国山核桃C.illinoensis种内嫁接亲和性进行了研究。范平桦等[23]根据美国山核桃C.illinoensis的Aux/IAAs基因家族在嫁接愈合中的表达模式，挖掘出4个高表达基因，它们可能在嫁接愈合过程中起重要作用。兖攀等[24]以美国山核桃C.illinoensis品种“马罕”的2年生实生苗为砧木，采用切接法嫁接“波尼”品种1年生枝，对嫁接愈合过程进行了组织细胞学观察。目前，以枫杨为砧木的核桃嫁接愈合过程的组织解剖学观察研究尚未见报道。本研究首次运用解剖学方法，通过光学显微镜与透射电镜观察核桃/枫杨嫁接组合的愈合过程，了解其愈伤组织形成、对接、维管束桥形成及维管分化等过程，以及愈合过程中组织细胞的变化特点，以期为改进核桃/枫杨组合嫁接技术，提高嫁接成活率，揭示其嫁接愈合机理，提供组织细胞学依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

试验地点为湖南省岳阳职业技术学院苗圃。核桃J.regia接穗取自中国农业科学院郑州果树研究所核桃良种繁育基地，为6～8年生的“中核短枝”核桃品种的1年生枝。砧木为2年生湖南野生枫杨Pterocaryastenoptera实生苗，高100～150 cm，地径1.5 cm左右。

采用改进的方块芽接法嫁接，嫁接时间为2020年6月20日。分别于嫁接后3、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、45 d采样，每个时间点采集4个嫁接茎段，在嫁接切面纵向切取包含木质部、韧皮部和愈伤组织的长方形样，长5～6 mm。样品用甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液[配方：38%甲醛(福尔马林)5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL，甘油(丙三醇)5 mL]固定，4 ℃低温保存，以备制作切片。

1.2 切片制作及观察

切片前处理：样品用2.5%戊二醛固定2～4 h→磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH值7.0。配制方法：取0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液61 mL、0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液39 mL混合配成母液，加1倍双蒸水即可)清洗3次→1%锇酸浸泡4～6 h→磷酸缓冲液清洗3次(每次清洗20 min)→在室温下用30%、50%、70%、80%、95%丙酮和纯丙酮逐级脱水(每级30 min，每级丙酮液换3次)→用Epon812环氧树脂包埋。

切片：用Lecia RM2245轮转式切片机制作10 μm厚石蜡切片，用超薄切片机制作厚度50～70 nm超薄切片。

观察：石蜡切片用2.5%过碘酸脱掉树脂和锇酸，甲苯胺蓝染色，Leica DM5000光镜观察并拍照；超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，日本日立公司H-7800透射电镜下观察并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 枫杨砧木与核桃接穗的解剖结构

从图1-1、图1-2、图1-3可看出，接穗核桃与砧木枫杨解剖结构相同，从外到内依次均为周皮、皮层、韧皮部、形成层和木质部。两者都有发达的韧皮部，有大量的韧皮纤维，其中，砧木的韧皮部纤维有单列和二列，接穗多为单列。两者木质部的木纤维也都非常发达，均有丰富的导管。接穗的木射线多为单列，砧木木射线有单列与二列。生长期，两者的形成层均较厚，有6～8层，也均呈扁平状紧密排列。可见，虽然枫杨与核桃为胡桃科的不同属，但组织结构相似程度较高。

图1 枫杨与核桃嫁接愈合过程的显微结构观察

2.2 嫁接口愈合过程的显微结构

2.2.1 隔离层的形成期 核桃/枫杨嫁接后3 d，在砧木与接穗的切削面上分别可以观察到由受伤死细胞堆积的一颜色较深的薄层(见图1-4)，砧木与接穗的隔离层同时形成。

2.2.2 愈伤组织形成期 核桃/枫杨嫁接后6 d，砧木与接穗隔离层两侧的形成层细胞被激活，进行旺盛的细胞分裂，产生柔软的愈伤组织薄壁细胞，其与形成层较规则的“砖块”形状不一样，细胞普遍变大，且大小不一，呈现为不规则多边形，液泡化程度高，排列杂乱无序(见图1-5)。同时发现，隔离层增厚，且核桃接穗产生的愈伤组织薄壁细胞比枫杨砧木多(见图1-5)。

嫁接后8 d，砧木与接穗持续产生大量愈伤组织，径向薄壁细胞层数增加了十几层，并且接穗与砧木各自产生的愈伤组织薄壁细胞部分相互抱合，出现细胞融合现象(见图1-6)。

2.2.3 形成层环形成期 嫁接后10 d，愈伤组织薄壁细胞开始慢慢变成圆形或长圆形，且排列紧密，部分突破了隔离层，形成了连接砧穗的愈伤组织桥(见图1-7)。愈伤组织桥的出现，可尽早实现砧木为接穗提供营养和水分，对嫁接成活起着关键性的作用。愈伤组织突破隔离层形成愈伤组织桥被认为是砧穗亲和性的重要标志之一[10-11]。

嫁接后12～18 d，接穗与砧木形成层旁的薄壁细胞持续分化出新形成层，同时愈伤组织也分化出原形成层，砧、穗薄壁细胞分化的新形成层逐渐与愈伤组织分化的原形成层连接，最后形成完整的形成层环(见图1-8)。同时，皮层的薄壁细胞形成大量愈伤组织(见图1-9)。

2.2.4 维管组织分化形成期 嫁接后20 d，随着愈伤组织的不断增生，在愈伤组织某些区域分化出管状分子和筛分子，互相连接并贯穿，进而形成连接砧穗的维管束桥(见图1-10)。随着维管束桥的出现，砧木增强了对接穗营养和水分物质的输送，加快了组织的分化，维管束桥中的形成层促进产生更多连接接穗的维管组织。嫁接30 d后，新的维管形成层向外形成次生韧皮部，含有新生的筛管，向内形成木质部和次生木质部，有新生导管产生，砧穗连为一体(见图1-11)。

2.3 嫁接口愈合过程的超微结构

嫁接3～14 d，嫁接切口面的细胞因切伤破损，形成层细胞受到创伤的刺激，细胞原生质体缓慢降解或消失，部分细胞壁破裂，其细胞质被挤压形成隔离层(见图2-1、图2-2)。相邻薄壁细胞的细胞壁破裂后，解体的絮状原生质体相互融合在一起(图2-3)。受伤严重的细胞内，中央的大液泡消失，出现多个的小液泡，细胞质呈棉絮状，细胞质中出现油滴现象，呈现明显的愈伤反应现象(图2-4、图2-5)。韧皮部、木质部的薄壁细胞间的胞间连丝明显，胞间连丝经常成群形成于细胞壁较薄的位置(图2-6)。此期的愈伤组织呈不规则排列，薄壁细胞之间有较大间隙(图2-7)。在愈伤组织细胞的细胞壁和细胞膜之间出现囊泡状的壁旁体、多泡体(图2-8、图2-9)。在嫁接切口面附近2～3层细胞内含有大量线粒体、淀粉粒(图2-10、图2-11、图2-12)。

图2 愈合过程中愈伤组织细胞超显微结构

续图2

与隔离层相邻的细胞，原生质减少，中央大液泡将原生质推向细胞壁周边(图2-13)。有些薄壁细胞显著膨大，周边细胞被挤毁(图2-14)。

在形成层两边的愈伤组织薄壁细胞分泌出果胶质到细胞壁外，呈圆珠状，夹在相邻细胞壁中间，相当于中层，随着果胶积累，愈伤组织薄壁细胞显著增厚(图2-15和图2-16)。

嫁接后30～45 d，果胶质在细胞壁复合体中逐步分散、消失，并产生胞间连丝(图2-17，图2-18)；形成层带细胞内有多个小液泡，且有丰富的蛋白质、线粒体等，细胞质呈絮状，仍呈现明显的愈伤组织反应(见图2-19)。

3 讨论

一般而言，若砧木和接穗组织结构相似，则嫁接后的亲和性较好[25]。通过枫杨砧木与核桃接穗解剖的光学显微结构比较，发现二者组织结构相似度高，这可能是胡桃科不同属的枫杨和核桃具有嫁接亲和性的原因之一。

通过嫁接口愈合过程的显微结构解剖学观察发现，核桃/枫杨嫁接组合的愈合过程也可大致分为4个阶段：隔离层形成期、愈伤组织形成期、形成层环形成期和维管组织分化形成期[17-18，24，26-31]。且嫁接后20 d左右形成愈伤组织桥、形成层环、维管束桥，是嫁接成活的关键时期，因此，这段时期要创造有利的嫁接环境。同时还观察到以下现象：砧木与接穗隔离层同时形成，但核桃接穗的愈伤组织薄壁细胞大量产生的时期比枫杨砧木早。皮层薄壁细胞也可形成大量愈伤组织，说明了形成层不一定是愈伤组织形成的唯一来源；但形成层的愈伤组织的形成一定先于皮层愈伤组织产生，是愈伤组织形成的主要来源。接穗与砧木各自产生的愈伤组织薄壁细胞相互融合的形态、愈伤组织桥的形态、形成层环的形态、维管束桥的形态以及新生维管组织的形态等，这些显微结构的观察发现将为改进枫杨与核桃嫁接技术，提高嫁接成活率，揭示嫁接亲和性机理提供组织细胞学依据。

嫁接初期受伤的细胞形成隔离层，隔离层两边的细胞会出现细胞器变化，内膜系统重组，物质转移等系列愈伤反应[32-33]。本研究通过嫁接后超微结构观察发现，核桃/枫杨嫁接初期接口面相邻细胞间细胞壁破裂后，出现了细胞融合现象，这与显微结构观察的现象一致。同时，隔离层两边细胞的线粒体和淀粉粒增加，出现用以转运物质的壁旁体和多泡体等，还观察到了细胞质的油滴现象，这些现象均属于愈伤反应[17-21]。嫁接初期愈伤组织会分泌果胶质，且使细胞壁增厚约三倍，果胶质渗入隔离层起到“黏合剂”作用[17-18]。本研究超显微结构观察也发现，核桃/枫杨嫁接前期，形成层两边的薄壁细胞产生了果胶质，使细胞壁明显增厚，在嫁接成功后果胶质逐渐消失，并在较薄的地方出现胞间连丝；但有些果胶质并没有渗透入隔离层，一直到嫁接成功后慢慢消失。

4 结论

枫杨砧木与核桃嫁接后的前20 d左右形成愈伤组织桥、形成层环和维管束桥，是嫁接成活关键时期。形成层不是产生愈伤组织的唯一来源，皮层也可形成愈伤组织。嫁接初期隔离层两边的细胞会出现细胞器变化，内膜系统重组，物质转移等系列愈伤反应。