连作对百香果根际土壤微生物群落的影响

邹毅辉，徐婧君，陈育青，黄红宣，2

(1 漳州卫生职业学院药学系，福建漳州，363000；2 漳州市现代中药重点实验室，漳州，363000)

百香果PassifloracoeruleaL.，又名鸡蛋果，西番莲，是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属草质藤本植物，栽培于广东、海南、福建、云南、台湾，有时逸生于海拔180～1 900 m的山谷丛林中[1]。近年来，国内外学者对百香果、百香果汁以及副产物(果皮、果叶、种籽)进行了研究，发现百香果主要含有黄酮类、三萜类、生物碱等，具有抗氧化、抗菌、神经保护作用等多种生物活性[2]。福建省百香果种植面积近1.33万hm2，年产值50亿元，惠及10万农户，带动农户户均增收4万元以上。

虽然百香果产业发展积极性高，但病害问题日渐突出，易感病毒[3]、细菌和真菌病害[4]，栽培百香果具有明显的连作障碍现象。连作障碍是指在同一土壤上种植同一作物多年，由于土壤质量的耗损，害虫和有害土壤微生物群落的增加，导致产量下降。连作多年的百香果园地，即使是重新栽种的植株，生长情况及产量也远低于新开垦种植园[5]，连作障碍严重影响百香果产业发展。

土壤微生物多样性是维持土壤健康和肥力的关键因素，土壤中分布广泛的微生物与土壤的重要功能息息相关[6]。根际土壤微生物参与了保持土壤生态结构、土壤养分循环、病虫害控制和污染物降解等提升土壤生产力过程[7]。有研究报道，连作影响根际土壤微生物结构，因此，根际土壤微生物群落结构与连作障碍的关系日益受到关注[8-10]。对连年种植的西瓜根际土壤微生物群落组成研究发现，连作后根际土壤微生物细菌群落多样性下降而真菌群落多样性上升，不同种植年限的西瓜根际微生物群落组成存在显著差异[11]。胡萝卜[12]、枸杞[13]和香草[14]等作物连作也会使根际土壤菌群多样性下降，使菌群结构退化，导致根际微生态失衡，从而引发连作病害。连作百香果的根际土壤微生物多样性变化和群落结构组成鲜见报道。

高通量测序具有成本低、通量高和信息丰富等特点，使其在土壤微生物研究中的应用具有优越性[15]。从土壤中提取DNA后进行高通量测序为土壤生物多样性监测和评估提供了可能性。本研究通过Illumina MiSeq高通量测序技术，分析百香果根际土壤细菌和真菌群落的组成和结构，探索连作百香果根际土壤细菌和真菌群落变化规律，为揭示百香果连作障碍机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

福建省漳州市华安县绵治村，平均海拔600 m左右，年平均气温17.5～21.4 ℃，年平均降雨量1 700 mm，属于南亚热带季雨林气候，土壤红壤。2020年6月26日，在当地选取相邻的百香果新植园和连作3年试验地，沿“S”形路径在每个样方内选择百香果10株，取1～10 cm深度的根际土壤，抖落并用小毛刷收集根际土壤至无菌培养皿中保存备用，将每个样方内取得的10份根际土壤混匀为1份土样，每个样方重复3次。采集的样本放置于冰盒中带回实验室-20 ℃冰箱保存待测。

1.2 根际土壤DNA提取及PCR扩增

以OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒进行土壤DNA提取，利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量。PCR所用的引物为细菌16S V3-V4区341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)[16]，真菌18S V4区18SV4F(GGCAAGTCTGGTGCCAG)和18SV4R(ACGGTATCTRATCRTCTTCG)[17]。以第一轮的PCR产物为模板，使用Illumina桥式PCR兼容引物进行第二轮扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测定量后纯化回收，由生工(上海)生物工程有限公司的Illumina-MiSeq平台进行高通量测序。

1.3 数据分析

利用Cutadapt、Pear、Prinseq、Usearch和uchime软件进行序列的质量筛选和优化。以97%相似度对样本序列进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)聚类，利用Alpha分析物种多样性和丰富度。利用RDP classifier及Silva数据库分析样本中不同分类水平上的微生物群落结构及组成[20-22]。采用Excel软件进行数据整理，采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 微生物群落丰度与多样性分析

细菌16S高通量测序后共获得624 213条有效序列，真菌18S高通量测序后共获得488 535条有效序列。经与数据库比对后，细菌16S共获得10 570个OTU，真菌18S共获得3 942个OTU，样本文库的覆盖率达到了99.4%以上，说明测序数据量达到饱和，能够真实地反映样品根际土壤微生物的群落组成。

通过Alpha多样性指数分析微生物群落的丰富度和多样性，包括Chao1指数、ACE指数、香农指数和辛普森指数。群落丰富度的指数主要包括Chao1指数和ACE指数，指数越大，群落丰富度越高。由表1可以看出，新植园根际土壤的细菌Chao1指数和ACE指数低于3年连作园，说明连作后根际土壤的细菌群落丰富度增加；群落多样性指数包括香农指数和辛普森指数，香农指数越大，群落多样性越高，辛普森指数越大，群落多样性越低。新植园根际土壤样本的细菌香农指数高于3年连作园，辛普森指数低于3年连作园，说明连作后样品根际土壤的细菌群落多样性降低，两者差异显著。新植园根际土壤样本的真菌Chao1指数和ACE指数低于3年连作园，两者差异显著；而香农指数升高，辛普森指数下降，但差异不显著，说明连作后根际土壤真菌的群落丰富度显著增加，群落多样性升高(见表1)。

表1 福建省漳州市华安县绵治村百香果不同种植园根际土壤细菌和真菌的Alpha多样性分析

2.2 细菌群落组成与群落结构

细菌门水平的差异性分析结果显示，两个样本根际土壤的优势菌门(相对丰度>5%)均为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度比较低(2%～5%)。连作后的根际土壤中变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度分别增加了5.86个百分点和2.21个百分点，放线菌门(Actinobacteria)减少了3.40个百分点(见图1)。

图1 福建省漳州市华安县绵治村百香果不同种植园根际土壤门水平上的细菌群落结构

细菌属水平上的差异性分析结果显示，新植园土样相对丰度排名前五的细菌属为Gp2、unclassified_Gammaproteobacteria、unclassified_Bacteria、unclassified_Acidobacteria_Gp1、unclassified_Rhodospirillaceae。3年连作园土样相对丰度排名前五的细菌属为Gp2、unclassified_Gammaproteobacteria、unclassified_Bacteria、unclassified_Acidobacteria_Gp1、unclassified_Xanthomonadaceae。3年连作园根际土壤中γ-变形菌纲未分类属unclassified_Gammaproteobacteria相对丰度增加了5.55个百分点，黄单胞杆菌科未分类属unclassified_Xanthomonadaceae相对丰度增加了6.03个百分点，酸杆菌门中Gp2相对丰度降低了3.90个百分点(见图2)。

图2 福建省漳州市华安县绵治村百香果不同种植园根际土壤属水平上的细菌群落结构

2.3 真菌群落组成与群落结构

真菌门水平上相对丰度显示，新植园根际土壤主要的优势真菌门为子囊菌门(Ascomycota)，相对丰度为75.82%；3年连作园根际土壤主要优势真菌门为子囊菌门(Ascomycota)和毛霉门(Mucoromycota)，相对丰度分别为47.41%和21.19%。3年连作园的根际土壤中子囊菌门(Ascomycota)减少了28.41个百分点，而毛霉门(Mucoromycota)增加了14.73个百分点(见图3)。

图3 福建省漳州市华安县绵治村百香果不同种植园根际土壤门水平上的真菌群落结构

真菌属水平上相对丰度显示，枝孢霉属(Cladosporium)、子囊菌属(Archaeorhizomyces)、小被孢霉(Mortierella)、孢子丝菌属(Sporothrix)、粪壳菌属(Sordaria)、镰刀菌属(Fusarium)、粪盘菌属(Ascobolus)、枝瑚菌属(Ramaria)为丰度较高菌属。3年连作园的根际土壤的子囊菌属(Archaeorhizomyces)、孢子丝菌属(Sporothrix)、粪壳菌属(Sordaria)减少了11.80个百分点、6.63个百分点和6.52个百分点，小被孢霉(Mortierella)、镰刀菌属(Fusarium)分别增加了8.35个百分点和4.05个百分点(见图4)。

图4 福建省漳州市华安县绵治村百香果不同种植园根际土壤属水平上的真菌群落结构

3 结论与讨论

植物根际土壤中包含病原微生物，它们可以引起植物病害或者产生有毒物质，从而对植物生长产生不利影响。在农业生产中，如何通过农业生产措施有效维持植物健康的根际微生物群落，从而提高植物抗病性、抗逆性、养分利用效率等，是未来研究的重要方向[20-22]。有益微生物减少和病原微生物富集可引发植物各种土传病害，导致土壤微生物群落组成多样性失衡，这是造成连作障碍的根本原因[24]。本研究利用Illumina高通量测序技术分析百香果连作后根际土壤微生物群落变化，连作后根际土壤的细菌群落丰富度增加，细菌群落多样性降低；真菌群落丰富度显著增加，群落多样性升高。连作后根际土壤中细菌群落多样性降低，真菌群落多样性增高，导致土壤由“细菌型”向“真菌型”转化，这是百香果连作病害频发的一个重要因素。

百香果连作后根际细菌群落多样性的降低主要是由于细菌类群的相对丰度变化引起的。分析细菌群落组成发现，连作后百香果根际土壤中放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度显著减少。这一结果与不同连作年限马铃薯、西瓜、甘薯土壤细菌多样性研究结果一致[11，25-26]。放线菌门细菌(Actinobacteria)是土壤养分供给的主要来源，也是生态系统中最为广泛的细菌门类之一。放线菌可以通过产生抗菌和杀线虫化合物来预防一些土传病害[27]；而细菌性疾病和线虫也是引起百香果产量减少的重要原因。在细菌属水平上，3年连作园根际土壤中黄单胞杆菌科未分类属unclassified_Xanthomonadaceae相对丰度显著增加，而黄单胞菌属中大部分成员是植物致病细菌，引起的植物病害遍布全世界[28]。

分析真菌群落组成发现，连作园根际土壤中主要的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和毛霉门(Mucoromycota)。子囊菌门(Ascomycota)是养分循环中的重要分解者，在真菌群落中占主导地位[29]。百香果连作后，子囊菌门(Ascomycota)相对丰度显著降低，进而可能极大地影响百香果植株的生长发育。镰刀菌是土传病害中主要致病真菌，百香果的茎基腐病和枯萎病主要由于镰刀菌引起[30-31]。连作百香果根际土壤中镰刀菌属(Fusarium)真菌丰度增加了8.35个百分点，镰刀菌丰度的增加是导致百香果连作障碍的重要原因；镰刀菌也是百合、草莓、苹果等植物连作障碍的有害真菌[32-34]。生物熏蒸土壤消毒[35]、微生物菌肥[36]、豆科绿肥[37]、石灰联合碳铵熏蒸[38]、轮作[39]等方法可以改变土壤微生物菌群结构，降低镰刀菌属真菌的相对丰度。这些方法可以作为克服百香果连作障碍的绿色环保措施。

本试验利用高通量测序方法对比分析了百香果新种园和连作园根际土壤中微生物多样性和群落组成结构差异性，发现连作会使根际土壤微生物群落发生改变，根际土壤中致病菌增加，可能进而导致植株发病率增加，产量减少。根际土壤中有益菌数量下降同时，病原菌数量急剧增长，微生物群落结构的改变不利于作物的生长，最终导致种植单一作物出现严重连作障碍。根际土壤菌群结构组成的改变引发了连作障碍，这一结果在其他作物上也得到印证。本研究从土壤微生物角度揭示了连作导致百香果发病率升高，产量降低的因素，为防控百香果连作障碍提供参考。