不同商品发酵菌剂对牛粪堆肥微生物群落的影响

赵欧亚， 侯利敏， 孙世友， 茹淑华， 肖广敏， 王 策， 王 凌， 刘 蕾， 张国印， 李瑞军

(1.河北省农林科学院农业资源环境研究所/河北省肥料技术创新中心，河北石家庄 050051；2.河北省饶阳县农业农村局，河北饶阳 053900)

作为畜禽养殖大国，我国每年的畜禽粪便产生量约为18亿t，然而综合利用率不到60%，这严重制约了畜禽粪便资源化循环利用的步伐，同时粪污不恰当处理会造成严重的环境风险。好氧堆肥技术可以实现氮磷养分的高效循环，是有机废弃物再利用的主要技术。已有研究发现，在畜禽粪便堆肥发酵过程中添加微生物菌剂，发酵效果明显好于自然堆肥，可以有效减少粪便中的病原微生物，促进纤维素等难降解物质的分解，且腐熟程度更好，同时不同菌剂对粪便堆肥具有不同的效果。也有研究发现，接种菌剂有利于堆肥中的有机质分解、降低氨气和二氧化碳的释放浓度，减排作用显著。目前，大多数研究集中于不同发酵菌种对堆肥过程中养分指标变化及大肠杆菌菌落数、蛔虫卵数、发芽率等有机肥质量限制指标的影响，基于高分子通量技术的畜禽粪便堆肥微生物群落结构的研究相对较少。徐莹莹等通过采用传统培养与聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术相结合的方法，研究接种菌剂对牛粪堆肥反硝化细菌群落的影响，结果表明，接种菌剂后加快了反硝化细菌群落的演替速率，并且从接种菌剂堆肥中检测到自然堆肥中不存在的反硝化细菌类群。许修宏等采用高通量测序技术研究牛粪自然堆肥过程中细菌群落的动态变化，发现堆肥过程中细菌群落结构发生了显著变化，变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度在堆肥前期和高温期较高，酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度在堆肥后期较高。目前，对接种不同商品发酵菌剂条件下牛粪堆肥中微生物群落结构变化的研究尚未见报道。因此，本研究采用高通量测序技术，选取堆肥升温慢、发酵周期长、降解难的牛粪作为堆肥原料，以奶牛养殖厂附近小米加工厂所产生的米糠为配料，研究牛粪发酵过程中添加不同发酵菌剂对堆肥微生物群落结构的影响，以期为牛粪快速发酵商品菌剂的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于河北省冀丰动物营养科技有限责任公司进行，牛粪为该公司产生的新鲜粪便，米糠购自该公司附近的小米加工厂。发酵菌剂编号如下：菌剂A为复合微生物产物，由北京航天恒丰科技股份有限公司生产，包含枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、毕赤酵母、赤热链霉菌等菌种，有效活菌数≥200亿CFU/g，用量为0.10%(质量分数)；菌剂B为复合微生物产品，由广州微元生物科技有限公司生产，其中包含多种芽孢杆菌、酶制剂、酵母菌、丝状真菌等，有效活菌数≥200亿CFU/g，用量为0.01%(质量分数)；菌剂C为有机肥发酵菌剂，由沧州兴业生物技术有限公司生产，由多种功能性有益微生物组成，如细菌、真菌、放线菌、细黄链霉菌和酵母菌，有效活菌数≥80亿CFU/g，用量为0.10%(质量分数)；菌剂D为有机肥发酵菌剂，由沧州旺发生物技术研究所有限公司生产，包含枯草芽孢杆菌、放线菌酵母菌、巨大芽孢杆菌、胶冻芽孢杆菌、里氏木霉、纤维素酶等，有效活菌数≥100亿CFU/g，用量为0.10%(质量分数)。

1.2 试验设计

本试验共设5个处理，包括对照(不添加发酵菌剂)、菌剂A、菌剂B、菌剂C和菌剂D，详见表1，菌种添加量均参照商品使用说明进行添加。每个处理设3次重复，各处理原料按质量分数配比均为70%牛粪+30%谷糠，碳氮比调节在25～35，含水率为60%～65%，混合均匀后将物料进行条垛式堆肥，每个堆体长2～3 m，堆底宽1.5 m、高1.0 m，堆体间的间隔为2～3 m。发酵周期为60 d，每隔7 d翻堆1次。于2020年5月21日起堆，7月21日结束。各菌剂按照产品使用说明进行添加，具体用量如表1所示。

表1 不同组别的发酵菌剂添加量

1.3 测定指标

温度的测定：将温度计插入距离堆体顶部 50 cm 处测量温度，每天10：00、16：00各测量1次，以2次测量的平均值作为当天的堆体温度，同时记录周围环境温度。堆肥结束时采集样品，测定微生物指标，采样深度为距堆体顶部50 cm处，采用5点取样法取样后混合均匀。委托上海派森诺有限公司进行微生物多样性的测定，其中真菌群落结构测序所用引物序列为：F，5′-G G A A G T A A A A G T C G T A A C A A G G-3′；R，5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C-3′，测序区域为ITS_V1，方法为DADA2。细菌放线菌测序所用引物序列为：F，5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C A-3′；R，5′-T C G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′，测序区域为16S V3～V4区，数据库为silva_132，方法为DADA2。

1.4 数据处理

用Excel、SPSS V17.0进行分析，微生物多样性分析用派森诺基因云软件。

2 结果与分析

2.1 不同发酵菌剂处理下牛粪堆肥温度的变化

如图1所示，添加发酵菌剂可以有效提高堆肥温度。对堆肥过程中温度变化规律的分析结果表明，添加菌剂A(T处理)、菌剂B(T处理)、菌剂C(T处理)、菌剂D(T处理)后，堆肥平均温度分别较CK处理提高了5.70、2.84、6.33、5.36 ℃。在不同发酵菌剂处理下，堆肥温度的增速不同，在CK处理下，堆肥进入高温期(50 ℃以上)需要9 d；在T处理下，堆肥3 d进入高温期；在T、T处理下，堆肥进入高温期均需要5 d；在T处理下，堆肥进入高温期所需的时间与CK一致。由此可见，在T处理下堆肥的增温效果最好。

2.2 不同发酵菌剂处理堆肥中真菌群落结构的变化

2.2.1 丰度与多样性分析 由表2不同处理下真菌丰度与多样性可以看出，在不同处理下，真菌高质量序列数量为63 473～67 866条，将经过处理的高质量序列通过100%相似度的划分，各处理得到214～285个特征序列(ASV)。在CK处理下，ASV数量为239个；T处理下的ASV数量与CK接近；在T处理下，ASV数量为214，较CK减少10.46%；在T、T处理下，ASV数量均为285个，比CK处理高19.25%。

表2 不同发酵菌剂处理堆肥中的真菌丰度与多样性

Shannon指数是群落多样性指标，其值越大，表明群落多样性越高，反之表明群落多样性越低。如图2所示，在添加发酵菌剂B处理(T)下，真菌微生物多样性指数(Shannon指数)显著低于对照处理、添加其他发酵菌种处理；同时在CK、T、T、T这4个处理下，真菌微生物多样性指数间无显著差异。

对不同发酵菌剂处理下堆肥中真菌ASV的组成进行样本距离矩阵与主坐标分析(PCoA)的结果显示，在T处理的样品与CK最接近，表明添加发酵菌剂C处理(T)的真菌群落结构与CK间的差异较小，而添加发酵菌剂A、B、C处理(T、T、T)的菌群落结构与CK处理间的差异较大(图3)。

2.2.2 分类学组成分析 相对丰度排名前五的真菌门类如图4所示，分别为子囊菌门，相对丰度为59.35%；担子菌门，相对丰度为16.48%；被孢霉门、油壶菌门，相对丰度分别为2.33%、2.15%；毛霉门，相对丰度为0.08%；其他门的相对丰度为19.60%。

在牛粪堆肥中添加不同发酵菌剂后，主要影响子囊菌门、担子菌门真菌的相对丰度。与CK相比，T、T处理的子囊菌门相对丰度降低，担子菌门的相对丰度升高；T处理的子囊菌门、担子菌门的相对丰度均升高；T处理的子囊菌门的相对丰度升高，担子菌门的相对丰度降低。此外，添加不同发酵菌剂后，毛霉门的相对丰度均有所升高，升高幅度为0.1～0.4百分点。

图5为不同发酵菌剂处理下堆肥中属分类水平上的真菌群落种组成，可以看出，相对丰度排前10位的属分别为曲霉菌属、毕赤酵母菌属、马拉色霉菌属、链格孢菌属、镰刀菌属、、节担菌属、、嗜热子囊菌和被孢霉菌。在牛粪自然堆肥处理下，堆肥结束后样品中曲霉菌属的相对丰度最大，为1361，其次为毕赤酵母菌属，相对丰度为997，而链格孢菌属、镰刀菌属、、节担菌属、、被孢霉菌属的相对丰度为2.23%～4.25%，马拉色霉菌属、嗜热子囊菌属的相对丰度均小于1%。

通过分析不同发酵菌剂处理对堆肥中微生物群落的影响发现，与CK相比，T处理的堆肥微生物群落结构组成差异较小；在T处理下，堆肥马拉色霉菌属的相对丰度显著增加，且节担菌属、这2个属的相对丰度降低显著；在T处理下，毕赤酵母菌属、嗜热子囊菌属的相对丰度增加明显，增幅为2.39～3.48百分点，且节担菌属的相对丰度下降显著；在T处理下，各属相对丰度变化规律与T处理基本一致，毕赤酵母菌属、马拉色霉菌属、嗜热子囊菌属等3个属的相对丰度增加，其余7个属的相对丰度均有所下降。

2.3 不同发酵菌剂处理堆肥中细菌、放线菌群落结构的变化

2.3.1 群落丰富度及多样性 如表3所示，在各处理下，堆肥样品通过高通量测序得到83 614～94 552 条细菌、放线菌序列。经过处理的高质量序列通过100%相似度划分，得到181～285个特征序列。在未添加发酵菌剂的CK处理下，ASV数量为239；在T处理下，ASV数量与CK接近；在T、T处理下，ASV数量均低于CK，其中T处理的ASV数量下降24.27%；在T处理下，ASV数量为285，比CK处理高19.24%。

表3 不同发酵菌剂处理堆肥的细菌、放线菌丰度与多样性

样品中表示细菌、放线菌微生物群落多样性的Shannon指数如图6所示。与CK相比，T、T、T处理的细菌、放线菌微生物多样性降低，T处理的细菌、放线菌微生物多样性高于CK。

2.3.2 细菌、放线菌群落层次的聚类分析 在不同菌剂处理下，堆肥中细菌、放线菌群落层次的聚类分析结果见图7。可以看出，在CK、T处理下，3次重复样品之间细菌、放线菌微生物群落结构聚类结果较为集中，重复效果较好，且T处理与CK的聚类分析距离较远，表明在T处理下，微生物群落结构与CK间的差异较大。此外，T、T、T这3个处理的聚类分析距离较近，且均接近CK，表明在T、T、T这3个处理下，细菌、放线菌微生物群均与CK处理的细菌、放线菌群落结构接近。

2.3.3 分类学组成分析 图8为不同发酵菌剂处理堆肥中细菌、放线菌在门分类水平上的群落种组成，选取相对丰度排名前五的门类。在常规堆肥(CK)处理下，厚壁菌门的相对丰度为67.46%，其次是变形菌门，相对丰度为8.48%，放线菌门、的相对丰度均约为7.6%，拟杆菌门的相对丰度为2.42%，其他菌门的相对丰度为6.31%。

与CK相比，在T处理下，堆肥中放线菌门的相对丰度显著增加约8百分点，厚壁菌门的相对丰度显著下降了约7百分点；在T处理下，堆肥中放线菌门的相对丰度显著增加了约7百分点，同时的相对丰度显著下降了约7百分点；在T处理下，厚壁菌门的相对丰度显著下降了约18百分点，变形菌门、拟杆菌门的相对丰度增加了 4～5百分点；在T处理下，放线菌门、变形菌门的相对丰度分别增加了约9、2百分点，而子厚壁菌门、拟杆菌门、的相对丰度下降了1～5百分点。

由于厚壁菌门、拟杆菌门为产甲烷过程的优势群落，因此对这2种细菌的相对丰度之和进行分析。结果(图9)表明，在CK处理下，产甲烷菌的相对丰度之和最大，为69.88%；在T处理下，产甲烷菌的相对丰度和与CK基本一致；而在T、T、T处理下，产甲烷菌的相对丰度均低于CK，并以T处理下产甲烷菌的相对丰度之和最低，与对照处理相比显著降低了13.56百分点。由此可见，在牛粪堆肥过程中添加发酵菌剂C可使产甲烷菌的相对丰度之和显著降低约14百分点，从而有效降低堆肥过程中甲烷排放的风险。

3 讨论与结论

温度是决定微生物种群相对优势、评价堆肥效果的重要指标。本研究中，通过添加4种不同发酵菌剂均能有效提高牛粪堆肥过程中的温度，平均发酵温度较CK增加2.84～6.33 ℃；在添加发酵菌剂A、C、D处理下，堆肥温度升高至50 ℃以上所需时间分别为5、3、5 d，分别较CK提前4、6、4 d。堆肥温度上升至50 ℃后，持续高温时间超过 5 d，符合国家粪便无害化卫生标准。本研究结果与王信等得出的在牛粪堆肥后2～3 d进入高温期的结果存在差异，但与金香琴等通过微生物菌剂对畜禽粪便堆肥影响的研究得出的牛粪堆肥在 4～12 d 后温度上升到 50 ℃进入高温期的研究结果基本一致。本研究结果与张玉凤等得出的接种发酵菌剂处理下堆肥温度达到 50 ℃的时间比不接种处理提前 4 d、高温持续24 d的研究结果基本一致。此外，高云航等的研究结果表明，在环境温度较低时进行牛粪堆肥，接种发酵菌剂堆肥处理下11 d进入高温期。由此可见，堆肥发酵菌剂的升温时长还受环境温度影响。

在本研究中，不同菌剂处理堆肥的真菌优势群落(相对丰度大于5%)为子囊菌门、担子菌门，相对丰度分别为59.35%、16.48%，这与许修宏关于牛粪好氧堆肥中真菌群落组成研究得出的降温期优势菌为类子囊菌门的研究结果基本一致。不同发酵菌剂的添加均可促进马拉色霉菌属、嗜热子囊菌属、毛霉菌属菌株繁殖，增加其相对丰度；并对镰刀菌、、节担菌属、菌株繁殖产生抑制，降低其相对丰度，以节担菌属的抑制作用最为显著。不同菌剂处理堆肥中牛粪堆肥细菌的优势菌门为厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、，相对丰度总和约为91.14%。与CK相比，在T、T、T处理下，细菌、放线菌的微生物多样降低，在T处理下，细菌、放线菌的微生物多样性高于CK。本研究结果与王秀红等得出的牛粪与秸秆好氧堆肥优势菌门有厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门和浮霉菌门，其相对丰度总和为77.61%～94.26%的研究结果基本一致。

卢洋洋研究发现，添加外源微生物菌剂可以显著降低氨气、二氧化碳的释放浓度，温室气体减排效果显著，在堆肥的第5天，氨气浓度释放量峰值较CK下降14%～31%。在本研究中，在牛粪堆肥发酵过程中添加不同发酵菌剂主要会影响厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门的相对丰度。而厚壁菌门、拟杆菌门为产甲烷过程中的优势群落，甲烷的增温势更是为二氧化碳的25倍，具有极大的环境风险。在牛粪自然堆肥处理下，2种细菌的相对丰度之和达69.88%，添加发酵菌剂C可以显著降低厚壁菌门、拟杆菌门的相对丰度。与对照相比，2种细菌的相对丰度之和下降了14百分点，有助于降低牛粪发酵过程中甲烷的排放。综上可见，不同发酵菌剂产品的甲烷减排效果存在差别。关于提高添加发酵菌剂的环境效益、实现养殖废物氨减排、降低温室气体排放等方面的工作有待进一步研究。