嗜热链球菌发酵鲢鱼制品工艺参数的优化

杨闯徐灿兰时乐

（1上海海洋大学水产与生命科学学院，上海 201306；2湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

发酵鱼制品具有甜咸适中、风味独特、醇香浓郁、营养丰富等特点，深受国内外消费者的喜爱。目前，我国市场上常见的发酵鱼制品主要包括酒糟鱼[1]、臭鳜鱼[2-3]、发酵酸鱼[4-5]、鱼露[6-7]、发酵鱼粉[8]等，其制作过程主要采用传统盐渍发酵法。关于发酵鱼制品的研究，主要集中在发酵菌种的分离筛选[9-11]、产品品质和风味[12-13]以及发酵过程中微生物群落演替变化规律[14-15]等方面。发酵温度、制作环境、微生物菌群组成等诸多因素的影响，导致发酵鱼制品质量不稳定、亚硝酸盐含量高、发酵周期长和货架期短，进而影响消费者对发酵鱼制品的需求。为解决发酵鱼制品存在的问题，本文通过人工接种嗜热链球菌，系统研究发酵鲢鱼的影响因素，并通过统计分析软件对发酵条件进行优化，以期为发酵鲢鱼制品的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。供试材料包括新鲜鲢鱼、白砂糖、食盐、邵阳大曲，市购；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），由笔者分离并鉴定。

1.1.2 主要试剂。主要试剂包括蛋白胨、牛肉浸取物、酵母浸取物、葡萄糖、乙酸钠、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、柠檬酸二胺、二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸钠，均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产。

1.1.3 主要仪器设备。主要仪器设备包括霉菌培养箱（MJ-160C，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；高压灭菌锅（SS-325，TOMY KOGYO 公司）；单人单面超净工作台[SW-CJ-1B（U），苏州设备净化有限公司]；组织捣碎匀浆机（JJ-2，常州市华普达教学仪器有限公司）；可见光度计（V5000，上海元析仪器有限公司）。

1.1.4 培养基。嗜热链球菌斜面培养基：MRS固体培养基[16]。嗜热链球菌液体种子培养基：葡萄糖30 g、20%大豆浸煮液1 000 mL。以上培养基于115℃条件下灭菌30 min，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌种子液制作。 将保存于斜面培养基上的嗜热链球菌活化后，接种于液体种子培养基中，摇匀后于37℃培养箱中恒温静置培养24 h。

1.2.2 鲢鱼预处理。将鲢鱼去鳃、鳞、内脏和头后切成小块，洗净后沥干表面的水分，加入7%食盐常温下腌制2 d，平铺于托盘中，55℃烘干表面水分。

1.2.3 发酵条件研究。将烘干的鱼块置于玻璃瓶中，分别改变食盐添加量（5%、7%、9%、11%、13%）、白砂糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、酒精添加量（3%、5%、7%、9%、11%）、菌龄（24、48、72、96、120 h）、接种量（5%、10%、15%、20%、25%）和发酵时间（192、216、240、264、288 h）等，放于 37 ℃恒温培养箱中培养，分别考察不同因素对鲢鱼发酵的影响。

在单因素试验结果的基础上，用Design-Expert 8.0.5b软件，以水溶性氨基酸为响应值（R1），选择对发酵鲢鱼质量影响较大的因素发酵时间（A）、菌龄（B）和接种量（C）为自变量进行响应面优化设计，每个自变量取3个水平。响应面分析因素和水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平

1.3 测定内容与方法

1.3.1 理化成分检测分析。取发酵好的鱼制品按重量比加入20倍水，再用组织捣碎机充分捣碎，静置10 min，取上清液按参考文献[17-19]提供的方法测定发酵鲢鱼的水溶性氨基酸、还原糖含量和pH值。

1.3.2 感官评定。根据评定标准对样品进行感官评定。选择由厨师、普通市民、学生等10人组成的评定小组，对产品的色泽、滋味、香气、组织质地等逐一评分，计算综合得分[20]，以总分表示样品的总体感官品质。感官评分标准见表2。综合得分计算公式如下：

表2 酒糟鱼感官品质评分标准

2 结果与分析

2.1 食盐添加量对鲢鱼发酵的影响

从表3可以看出，在一定范围内，随着食盐添加量的增加，水溶性氨基酸含量随之增加。当食盐添加量为7%时，水溶性氨基酸含量最高，达1.87%，当食盐添加量超过7%时，水溶性氨基酸含量下降。同时也可以看出，发酵鲢鱼中还原糖含量随食盐添加量的增加变化并不大，而pH值随食盐添加量的增加逐渐升高，说明提高食盐添加量抑制了乳酸菌活性而影响了鱼的发酵进程。从感官指标分析，除滋味在食盐添加量为5%时分数较低外，其他指标差异不大。因此，综合考虑理化指标和感官指标，确定食盐添加量为7%进行后续试验。

表3 食盐添加量对鲢鱼发酵的影响

2.2 白砂糖添加量对鲢鱼发酵的影响

从表4可以看出，随着白砂糖添加量的增加，感官评定参数中质地、色泽及综合得分随之增加，香气降低，滋味得分变化不大，还原糖含量先降后升。当白砂糖添加量为5%时水溶性氨基酸含量最大，为1.94%。综合考虑理化指标和感官指标，选取白砂糖添加量为5%进行后续试验。

表4 白砂糖添加量对鲢鱼发酵的影响

2.3 白酒添加量对鲢鱼发酵的影响

从表5可以看出，随着白酒添加量的增加，水溶性氨基酸含量逐渐降低，还原糖含量先升后降，感官指标得分及综合得分差别不大，说明白酒添加量对感官指标得分和综合得分无显著影响。因此，确定白酒添加量为3%进行后续试验。

表5 白酒添加量对鲢鱼发酵的影响

2.4 菌龄对鲢鱼发酵的影响

从表6可以看出，菌龄对发酵鲢鱼制品的感官指标得分和pH值影响不大，但随着菌龄增加，水溶性氨基酸含量呈先升后降的趋势。当菌龄为72 h时，发酵鲢鱼制品中水溶性氨基酸含量最大，达2.64%，菌龄超过72 h，水溶性氨基酸含量下降。因此，选择菌龄为72 h进行后续试验。

表6 菌龄对鲢鱼发酵的影响

2.5 接种量对鲢鱼发酵的影响

从表7可以看出，在一定范围内，随着接种量的增加，水溶性氨基酸含量也逐渐增加。当接种量为15%时，水溶性氨基酸含量最大，达2.72%；当接种量超过15%时，水溶性氨基酸含量显著下降。还原糖含量随接种量的增加而下降，推测原因可能是随着接种量增加，乳酸菌生长繁殖和代谢所需要的营养物质较多，导致水溶性氨基酸和还原糖含量下降。各处理之间pH值和各感官指标得分差异不大。

表7 接种量对鲢鱼发酵的影响

2.6 发酵时间对鲢鱼发酵的影响

从表8可以看出，随着发酵时间延长，发酵鲢鱼中水溶性氨基酸和还原糖含量呈先升后降的变化趋势。当发酵时间为240 h时，水溶性氨基酸和还原糖含量均最高，分别达到2.83%和0.75%；当发酵时间超过240 h，水溶性氨基酸和还原糖含量均显著下降，pH值呈现持续下降趋势，而感官指标得分在各处理之间差异不大。

表8 发酵时间对鲢鱼发酵的影响

2.7 响应面法优化结果

2.7.1 Box-Benhnken响应面法试验设计及结果。根据表9试验结果，采用Design-Expert 8.0.5b软件对试验结果进行二次多项回归拟合，获得以水溶性氨基酸为响应值的回归方程：

表9 嗜热链球菌发酵鲢鱼工艺响应面试验设计及结果

R1=2.78+0.000 1A-6.250E-0.03B-1.250E-0.03C+0.000 2AB+0.000 1AC-2.500E-0.03BC-0.69A2-0.58B2-0.60C2

由表 10 可知，A2、B2、C2对水溶性氨基酸的影响极显著（P＜0.01），说明发酵时间、菌龄、接种量是鲢鱼发酵的重要因素，表明回归方程的一次项、二次项的影响都是极显著的。该模型回归显著（P＜0.01），且失拟项不显著（P＞0.05），说明数据中没有异常点，模型适当，回归方程拟合度良好。

表10 水溶性氨基酸响应面结果方差分析

2.7.2 二次回归方程的方差分析。由表11可知，回归方程的复相关系数为0.996 0，表明99.6%的水溶性氨基酸变化可由此模型解释，与实际试验拟合较好；校正相关系数为0.9887，预测相关系数为0.9784，两者较为相近，说明其他因素的干扰较少。降解率变异系数为3.07%，信噪比28.637，说明该模型的可信度较高。因此，可以用上述模型代替真实试验对鲢鱼发酵品质进行分析和预测。

表11 二次回归方程的方差分析

2.7.3 水溶性氨基酸的响应面分析。采用Design-Expert 8.0.5b软件对水溶性氨基酸的回归模型进行分析。等高线形状可以反映各因素之间交互效应的强弱，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆则表示较显著[21]。

发酵时间和菌龄对水溶性氨基酸含量的交互作用见图1。由图1可知：发酵时间不变时，随着菌龄的增加，水溶性氨基酸含量呈现先上升后下降的趋势；当菌龄不变时，水溶性氨基酸含量随发酵时间的增加而增大，当发酵时间超过11 d时，游离水溶性氨基酸含量随发酵时间的增大迅速下降，同时二者的等高线图呈现明显的椭圆，说明发酵时间和菌龄之间存在显著的交互作用。

发酵时间和接种量对水溶性氨基酸的交互作用见图2。由图2可知，当发酵时间不变时，随着接种量的增加，水溶性氨基酸含量呈现先显著增长后显著降低的趋势。当接种量不变时，随着发酵时间的增加，水溶性氨基酸含量呈现先增长后降低的趋势。由等高线图可以看出，二者的交互作用不显著。

菌龄和接种量对水溶性氨基酸的交互作用见图3。由图3可知，接种量不变，随着菌龄的增加，水溶性氨基酸含量呈现先上升后下降的趋势。当菌龄不变时，随着接种量的增加，水溶性氨基酸含量成呈上升后快速下降的趋势，说明菌龄和接种量对水溶性氨基酸的交互作用显著。

2.7.4 适宜的发酵条件。为确定适宜的发酵条件，将回归方程分别对各自变量求一阶偏导数并令其为0，可以得到三元一次方程组，对此方程组求解得到嗜热链球菌发酵鲢鱼最适宜的发酵条件，从而获得最适宜的发酵条件组合：发酵时间255.12 h、菌龄68.16 h、接种量15.27%。在此条件下得到水溶性氨基酸理论产量为2.96%。

2.7.5 模型验证。为了验证模型的有效性，根据优化试验所得的各因素优化值，即发酵时间为255 h、菌龄为68 h、接种量为15.3%进行验证试验，重复3次，得到水溶性氨基酸含量分别为2.92%、3.05%、3.01%，平均含量为2.993%。试验值与理论值相对误差为1.13%，说明试验值与模型预测值拟合良好。

3 结论

嗜热链球菌发酵鲢鱼的工艺为：白砂糖添加量5%，白酒添加量3%，食盐添加量7%，发酵时间为255 h，菌龄为68 h，接种量为15.3%。通过验证，测得发酵鱼中水溶性氨基酸平均含量为2.993%，与理论值相对误差仅为1.13%，说明采用响应面分析法对利用嗜热链球菌发酵鲢鱼制备酒糟鱼的工艺进行优化是有效的。