蒲公英甾醇对顺铂诱导的急性肾损伤保护作用及其机制

陈 爽，唐笑梅，麻昊阳

（南京医科大学儿科学院，江苏南京 210029）

急 性 肾 损 伤（acute kidney injury，AKI）是 一种常见的临床综合征，其发病率高且呈逐年上升趋势。2015年一项横断面研究表明，我国住院病人AKI检出率高达2%，预测有290万AKI病人住院治疗，约有70万患者死于AKI[1]，而且存活的患者也易进展至慢性肾病乃至终末期肾脏病[2]。研究证实，急性肾小管坏死是AKI 发生最常见的原因[3]。在疾病状态下，肾小管上皮细胞对缺血缺氧、毒素等刺激非常敏感，极易受到损伤，发生变性、凋亡、坏死、脱落[4]。蒲公英甾醇是一种从蒲公英中分离出来的五环三萜成分，以往的研究显示其发挥着较好的抗炎作用[5-7]。中性粒细胞明胶酶相关的脂蛋 白 (Neutrophil gelatinase-associated lipoealin，NGAL)已被确定为早期检测AKI的有效的生物标志物，有研究表明，AKI患者的NGAL水平在可检测到的血清肌酐升高前24～48 h即显著升高[8]。本研究探讨蒲公英甾醇是否通过抑制炎症进而改善顺铂诱导的急性肾损伤，为临床治疗急性肾损伤提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物SPF级C57/B6小鼠 雄性C57/B6小鼠24只，年龄8周，体质量22～25 g，购于维通利华实验动物中心（合格证编号：20210416Abzz0600000683；伦理编号：IACUC-2007001）

1.2 试剂 蒲公英甾醇(纯度99.9%，成都瑞芬思生物科技有限公司，货号：1059-14-9)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6（IL-6）酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国Novus Biological公司)。冻干型注射用顺铂（山东齐鲁制药，国药准字H20023461，规格：冻干粉：20 mg）。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)多克隆抗体（武汉塞维尔生物科技）。ECL显色试剂盒（上海天能公司，货号：180-5001）。Trizol、cDNA一链合成试剂盒（日本Takara公司，货号：6210A）。qRT-PCR试剂盒（中国诺维赞生物技术有限公司，货号：Q221-01）。PAGE凝胶制备试剂盒（上海雅酶，货号：PG112）。

2 实验方法和步骤

2.1 动物模型的制备 将小鼠置于SPF级动物房饲养1周（小鼠自由饮水摄食，室温约25°C，湿度约50%）。随机分为 3 组：空白组（n=8）、顺铂组（CP）（n=8）、蒲公英甾醇+顺铂组（干预）（n=8）。于造模前24 h给与干预组蒲公英甾醇（10 mg/kg），腹腔注射，固定时间点每日一次直至实验结束。其余两组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，直至实验结束。蒲公英甾醇预治疗24 h后，给予CP组和蒲公英甾醇+顺铂组一次性腹腔注射顺铂22 mg/kg，诱导急性肾损伤，其余小鼠腹腔注射等量生理盐水。每日记录小鼠精神状况及体质量。于注射顺铂72 h后处死小鼠，经心脏采血，并留取双侧肾脏组织样本。

2.2 石蜡标本制作与过碘酸雪夫染色（PAS）染色 新鲜肾脏组织置于4%多聚甲醛中，固定24～48 h，经脱水，包埋后切片（3 μm）。于65 ℃烘箱中烘烤40 min后保存于切片盒。将石蜡切片放至65 ℃烘箱烘烤1 h直至石蜡熔化，经脱蜡、乙醇梯度水化后置于1%过碘酸氧化10 min（37 ℃），双蒸水充分洗涤，擦干水分放入Schiff氏液，浸泡40 min，自来水冲洗30 min，苏木素染细胞核1 min。1%盐酸酒精分化，自来水冲洗，返蓝后流水冲洗。梯度乙醇脱水、透明、封片，然后进行镜下观察。

2.3 肾组织小管损伤评分 选用PAS染色病理切片，在显微镜下观察肾脏组织病理形态，每张切片随机选取20个皮质区视野（×200），观察4种主要的急性肾损伤相关表现（肾小管上皮细胞变性，肾小管的肿胀、剥脱，管形形成，刷状缘丢失），其评分标准如下[9]，在任意肾单位中小管损伤所占比例：①正常肾小管：0分；②损伤＜25%：1分；③25%＜损伤＜50%：2分；④50%＜损伤＜75%：3分；⑤损伤＞75%：4分。

2.4 血清肌酐、尿素氮检测 小鼠麻醉后，经心脏采血留取小鼠血液，并用抗凝管收集小鼠血液。离心5 000 r/min（20 min），吸取上清，置于 -80 ℃冰箱保存。吸取70 μL上清并用140 μL生理盐水稀释3倍（加样过程中切勿产生气泡），采用生化分析仪（罗氏公司，型号：cobas8000）检测血肌酐（Scr）及尿素氮（BUN）水平。

2.5 肾脏组织NGAL mRNA表达水平的检测 取肾脏组织，提取总RNA，逆转录为cDNA，QPCR检测NGAL表达水平。引物序列如下：

2.6 肾脏组织NGAL蛋白表达水平的检测 取肾脏组织加入组织蛋白提取液，匀浆后按照二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒方法测定蛋白浓度，加入SDSPAGE蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer，5X)，沸水水浴10 min，配制10%的分离胶和12%的浓缩胶，加样，65 V，电泳45 min之后改为130 V恒压电泳的方法电泳；当溴酚蓝指示电泳到达底部或者根据预染蛋白质分子量的大小，判断是否停止电泳。随后转膜，一抗、二抗孵育，用凝胶成像系统成像，进行灰度分析。

2.7 统计学分析 应用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计学分析，实验结果数据以（±s）表示，使用one-way ANOVA分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 3组小鼠血尿素氮和血肌酐水平比较 顺铂组相较于空白组BUN(18.30±0.32 mmol/L，57.75±0.65 mmol/L)及SCr(19.79±0.49，80.03±0.95 μmol/L)水平均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；蒲公英甾醇处理后的干预组小鼠相较于顺铂组血清BUN(36.55±0.38 mmol/L，57.75±0.65 mmol/L) 及 Scr(39.65±0.62 μmol/L，80.03±0.95 μmol/L)水平均降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图1A、1B。

图1 3组小鼠血尿素氮和血肌酐水平比较

3.2 3组小鼠肾小管损伤情况比较 PAS染色发现，由顺铂引起的肾小管上皮细胞肿胀、剥脱及坏死，肾小管扩张及管形形成，基底膜刷状缘消失等病理改变在蒲公英甾醇干预组均得到显著改善（见图2A），与肾功能改善的结果一致。应用肾小管损伤评分对过碘酸雪夫染色（PAS）染色进行半定量分析，空白组小管评分为0，顺铂组小鼠的小管评分显著高于蒲公英甾醇干预组（26.00±0.96，13.13±1.63）,差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图2B。

图2 3组小鼠肾小管损伤情况比较

3.3 3组小鼠炎症反应水平比较 ELISA结果显示，与空白组相比，顺铂组小鼠血清TNF-α和IL-6的水平均升高，经蒲公英甾醇干预后TNF-α和IL-6的水平均降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图3。

图3 3组小鼠炎症反应水平比较

3.4 3组小鼠NGAL水平比较 顺铂组小鼠NGAL水平高于空白组，经蒲公英甾醇干预后可降低顺铂诱导的AKI模型小鼠中NGAL的mRNA和蛋白质水平，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 3组小鼠NGALmRNA和蛋白质水平

4 讨论

急性肾损伤(AKI)是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的复杂临床综合征，其发病率逐年上升，病死率居高不下，是肾脏病中的急危重症。近年研究证明，AKI是引起慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的重要原因，AKI 增加了CKD的风险[10]。而多项研究表明炎症在AKI向CKD转变的进程中发挥重要作用，AKI引发的炎性反应可激活炎症信号通路[11]，进一步导致肾脏损伤移至纤维化的发生。因此，当AKI发生后，有效的控制炎症对治疗AKI及抑制AKI向CKD的进展有重要意义。

既往在对小鼠酒精性和免疫性肝损伤的研究中发现，蒲公英甾醇能够显著降低炎性介质白细胞介素-1β、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子-a、γ干扰素等水平，从而对酒精性肝损伤和伴刀豆球蛋白诱导的免疫性肝脏损伤起保护作用[12]。而在乳腺炎的相关研究中发现蒲公英甾醇可降低大鼠iNOS和COX-2 mRNA表达，抑制NF-κB、MAPKs信号通路和促炎细胞因子的产生，对乳腺炎发挥抗炎作用[13]。蒲公英甾醇可能通过TGF-/Smad通路对小鼠耳廓痤疮模型发挥治疗作用，调节炎性因子的表达、改善小鼠胸腺组织形态[14]。本实验结果表明，在顺铂诱导的AKI模型中，顺铂会导致肾小管细胞损伤，坏死，诱发急性炎症反应。而使用蒲公英甾醇干预可有效降低顺铂诱导的AKI模型小鼠肾脏组织TNF-α、IL-6的水平，缓解炎性反应，使得肾小管上皮细胞变性，肾小管的肿胀、剥脱，管形形成，刷状缘丢失等损伤显著减轻，改善肾脏结构与功能。NGAL是一种敏感的肾小管损伤标志物。我们通过QPCR和Western-blot检测发现蒲公英甾醇可降低顺铂诱导的AKI模型小鼠NGAL的mRNA和蛋白质水平。表明蒲公英甾醇在损伤发生时可通过抑制炎症因子的表达，发挥抗炎作用，进而减轻肾脏损伤。

综上所述，本研究探讨了肾脏疾病中蒲公英甾醇对AKI的影响，在顺铂诱导的急性肾损伤模型里，发现蒲公英甾醇可通过减轻炎症反应进而减轻肾脏损伤，为急性肾损伤的治疗提供新思路。