葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-Pcy A的克隆、表达及其分子结构基础

汪海洋,朱格格,卢 婵,程 超,2,李 伟,方 庆,2

(1.湖北民族大学 生物科学与技术学院,湖北恩施 445000;2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室,湖北恩施 445000)

原核藻类(prokaryotic algae),兼有细菌和高等植物部分重要特性,如较快速的细胞分裂繁殖与光合作用产能等,在生物进化中地位特殊。其光合作用的主要细胞器是藻胆体(phycobilisome)。蓝藻(blue green algae),即蓝细菌,依靠藻胆体捕获并传递光能,被认为是某些藻类和高等植物叶绿体的祖细胞[1-3]。构成上,藻胆体为多亚基蛋白与有色辅基等有序结合的超大分子复合物[4-5]。藻胆蛋白(phycobiliprotein)多由α/β两类重要的亚基组成,而藻胆素(phycobilibins)即色基部分为开链四吡咯化合物。近年来,对藻胆体的作用机制及其体外有益活性研究较广[4,6-9]。

目前,针对资源性藻蓝蛋白研究[8,10-11]为该类型有机复合物或其单组分等深入开发运用提供了基础。藻胆素包含多种类型,通常以共价硫醚键与藻胆蛋白中的多肽链结合,吸收和传递光能。一般认为,藻胆蛋白只有结合色基后才具有光能捕获与能量转换的活性。试验表明藻胆蛋白的纯度愈高,对自由基清除的能力愈强[8]。由此可见,藻胆素对藻胆蛋白的体外活性具有促进作用。而且蓝藻含有4种藻胆素,互为同分异构体,在光能捕获和转化中的作用因自身结构而不同。这表明细胞内藻胆素的酶促合成存在差异。早期研究发现,藻蓝胆素(phycocyanobilin,PCB)是以血红素IX为前体,经藻蓝素铁氧还蛋白还原酶(Pcy A)的催化作用而形成[6]。

葛仙米(Nostoc sphaeroidesKützing),也被称为天仙米,学名拟球状念珠藻,属蓝藻门念珠藻目,是中国重要的食药两用的蓝藻之一[12]。研究显示,葛仙米富含人体必需的多种氨基酸及多糖等活性物质,具较重要的药源功效等[10]。现今中国居民对健康的需求已进入新时期,深入研究与开发葛仙米资源具有重要意义[12-13]。本研究克隆葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶关键基因Ns-Pcy A,在原核细胞中表达并探究其蛋白高级结构,为进一步深入了解和开发葛仙米藻蓝胆素的细胞内合成作用奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

葛仙米鲜样采自湖北恩施鹤峰。分子克隆用基本工具酶,载体等购于大连宝生物等公司(TaKaRa);引物由金斯瑞公司合成。

1.2 DNA的提取

葛仙米总DNA提取参考前述方法[14]。具体步骤包括:鲜样经无菌水冲洗4～5次,接种于固体培养基上,经3～4次反复继代消除其他杂菌,待成体细胞直径长至约2.5 mm后,进行总DNA抽提。取0.1 mg鲜样与800μL CTAB抽提液混匀,迅速研磨后65℃水浴30 min;离心5 min上清液置于新的离心管中,经氯仿-异戊醇(24∶1)处理后取上清液异丙醇沉淀,75%的乙醇洗涤后晾干,含RNA酶的dd H2O溶解,于-20℃冰箱保存,备用。

1.3 PCR反应

PCR反应体系为:模板DNA 1μL,Go Tap G2 Green Master Mix 5μL,引物混合物1μL,补加dd H2O至10μL;反应程序为95℃3 min,95℃30 s,50℃30 s,72℃45 s,72℃5 min,16℃10 min,扩增循环数设为30。据Pcy A基因(O.lucimarinusCCE9901)同源序列分析葛仙米对应基因组(Locus,NZ_CP031941)中的目的基因序列,设计Ns-Pcy A基因的引物为:上游Ns-phyA-F-Nde1:GGCATATGTCATTTACTTCTATAC;下游Ns-phy A-R-EcoR1:GAATT CTTATTTTAATGTTGGGAG。

1.4 克隆目的基因DNA

目的DNA与p MD18-T连接,采用42℃热激转化法将重组载体导入大肠杆菌细胞。在含抗生素(Amp,100μg/m L)的固体LB培养基上筛选单菌落,挑取单菌落37℃培养14 h后进行质粒提取并测序。

1.5 表达载体构建

采用限制性内切酶EcoR I和NdeI分别对克隆目的基因的质粒DNA和p Cold I载体进行消化,然后回收基因片段和线性化的载体,进行T4 DNA ligase连接反应。连接体系转化大肠杆菌细胞DH5α。再经质粒提取和测序鉴定重组表达质粒。目的基因测序由上海生工公司完成。

1.6 序列与蛋白结构分析

对目的基因Pcy A编码蛋白氨基酸序列,针对Nostoc种属基因序列,NCBI(National Center for Biotechnology Information)在线比对BLAST和Clustalw(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)分析;采用MEGA构建基于Neighbor-Joining方法的系统进化树;葛仙米Ns-Pcy A基因编码蛋白结构分析采用Swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org/)基于序列相似性的分子模拟。

1.7 目的蛋白的表达

将测序正确的重组表达质粒导入表达菌株BL21细胞中,进行0.1 mmol/L IPTG诱导表达4～12 h,超声破碎细胞(破碎功率为66 W,时间4～10 s,重复3次,间隔10 s),制备表达样品进行SDS-PAGE分析。

2 结果与分析

2.1 葛仙米Ns-Pcy A基因克隆

以CTAB法提取葛仙米总DNA为模板进行特异引物的PCR。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳(图1-A)。结果显示,参照DNA分子量标准(D1),目的基因泳道(K1)扩增得到1条长近800 bp的特异产物,与目的基因大小相符。

回收目的DNA,与载体p MD18-T连接。将连接产物转化大肠杆菌并挑取单菌落培养,提取质粒进行Nde1/EcoR1双酶切。琼脂糖凝胶电泳显示两个正确克隆质粒(p1,p2)相较对照DNA分子质量标准(M1),均能够切出2条DNA带型,其中较小的近800 bp,p1与p2很可能为正确克隆(图1-B)。测序分析显示,扩增克隆DNA产物与GenBank中一段目的基因DNA(CP031941.1,区段为4 451 478～4 452 221)完全相同,全长744 bp,包含起始密码和终止密码(TAA)。其预编码藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase)。以上结果表明葛仙米Ns-Pcy A克隆成功。

2.2 Pcy A基因编码蛋白与分子进化

Ns-Pcy A预编码一含247个氨基酸的多肽链(Genbank,WP_118167897.1)。同源序列比对分析,发现该Ns-Pcy A与其他几个同源蛋白氨基酸序列总相似性达95.66%,并为典型的富含半胱氨酸(7个Cysteine)蛋白(图2“#”标示);相较点型念珠藻(Nostoc punctiforme)的藻蓝素铁氧还蛋白还原酶,Ns-Pcy A氨基酸序列中存在8个较为显著的位点替换,包括N41D,Q121E,T131N and V196A等(黑色三角标示)(图2)。分子进化树显示,葛仙米Ns-Pcy A很可能源于点型念珠藻,而在发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)和普通念珠藻(Nostoc commune)同源蛋白中形成明显分支(图3)。这预示藻蓝素铁氧还蛋白还原酶生物学功能在不同念珠藻中可能存在变异。

2.3 目的蛋白表达

为进一步研究葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶,将目的基因Ns-Pcy A连接进入表达载体pCold I。提取连接转化子质粒,经琼脂糖凝胶电泳检测,6个质粒(#1～#6)中第#4比对照#1略大,很可能为正确重组质粒。测序鉴定显示,#4质粒目的基因序列处于载体pCold I上冷休克基因(csp A)启动子下游,重组表达载体构建成功(图4-A)。

目的基因Ns-Pcy A预编码蛋白质分子质量大小为28.24 ku。将表达载体#4质粒转入大肠杆菌BL21细胞经0.1 mmol/L IPTG诱导,分离上清和沉淀蛋白。12%SDS-PAGE电泳如图4-B显示,目的蛋白相较标准蛋白Marker(Pm泳道),在29.0 ku附近有明显积累(P4泳道),而对照(P1与P2泳道,未诱导大肠杆菌细胞样品上清和沉淀裂解样品)中没有出现相应大小的蛋白条带。目的蛋白在沉淀中较大量积累(P4泳道,箭头标示),上清中存量较少(P3泳道),表明目的基因在大肠杆菌中能够顺利表达。

2.4 藻蓝素铁氧还蛋白还原酶Ns-Pcy A分子构型

蛋白肽链的分子内折叠是形成其高级结构进而发挥功能的基础。高级结构模拟显示,目的基因编码蛋白Ns-Pcy A单分子主要包含α螺旋和β折叠等两类主要的二级结构。α螺旋和β折叠进一步形成类似三面夹心的高级结构,其中5个α螺旋分布于外侧;而8个β折叠处于螺旋形成的封闭空间中(图5-B),形成疏水内核。Ns-Pcy A为富含半胱氨酸蛋白,其肽链中有4个半胱氨酸(从N端起第2至第5个半胱氨酸)分别分布于β折叠片层中(图5-A)。胆绿素IV在藻蓝素铁氧还蛋白还原酶(Pcy A)作用下,还原D环与A环上的乙烯基团,从而形成藻蓝胆素PCB.Ns-Pcy A这种夹式构型有利于底物和产物的及时锚定或释放。

3 讨论

葛仙米(Nostoc sphaeroidesKützing)是中国重要的食药同源性原核藻类,在服务地域经济和社会发展方面其生物资源潜能亟待深入发掘[12-13]。作为辅基色素,藻蓝胆素是一类线性四吡咯结构的化合物,在藻类细胞中具有捕获和传递光能的功能[6,14-15]。这些同分异构体,因双键位置不同,引致吸收光谱不同并在特定的条件下呈现不同的颜色。同分异构体存在,也表明此类色基合成的关键酶可能不同。藻蓝胆素在细胞内合成的途径已经明确:血红素IX经氧化作用形成胆绿素IV,后者在藻蓝素铁氧还蛋白还原酶(Pcy A)作用下形成藻蓝胆素PCB[16-17]。藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎症、抑肿瘤与强免疫等重要活性[10,18-19]。本研究成功克隆葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-Pcy A,为进一步研究和开发葛仙米藻蓝素等的生物资源奠定了重要基础。

一般认为,藻蓝胆素对藻蓝蛋白体外活性具有促进作用。实际上,脱离多肽链的藻蓝胆素清除自由基等活性已被证实。这为藻蓝胆素和藻蓝蛋白的深入开发提供了基础[20-23]。生物体中,铁氧还蛋白还原酶(Ferredoxin-NADP+Reductase,FNR)非共价键结合黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅基,并作为电子传递链中的重要组成部分,在众多基础代谢中发挥作用;其中,辅酶NADP+是FNR催化反应的先决条件,分子偶极矩表面电荷的分布和数量保证了FNR与Fd定向关联,其中氢键、盐桥、范德华力及疏水作用起到稳定蛋白构象和功能的作用[24-28]。依赖铁氧还蛋白的胆色素还原酶氨基酸位点变异,或是其功能和进化的重要证据。蓝藻中Pcy A家族酶类功能或活性可能已经发生改变[29-30]。分子进化水平上,显示Ns-Pcy A与几个近源种内的同源蛋白谱系关系较近,为念珠藻的进化提供了分子证据[12]:即葛仙米可能是点型念珠藻的变异种,并以其为亲本进一步衍生出普通念珠藻和发状念珠藻。

Ns-Pcy A在体外功能有待深入研究。Pcy A蛋白第一个高分辨率的晶体模型被发现,为了解和发现其功能提供了基础[30-31]。笔者借助分子模拟发现,尽管存在部分氨基酸位点替换,但葛仙米Ns-Pcy A蛋白仍能够形成一α/β/α夹心式结构,其夹心空间及反向平行的β折叠片层利于底物和产物的及时锚定或释放。因此,笔者认为这种夹心式结构为其活性提供了重要支撑。并且,Ns-Pcy A为富含半胱氨酸蛋白,因此能够借助低电位铁硫基团以加强对曝氧等的防御[32]。半胱氨酸可能对于Ns-Pcy A蛋白具有双重意义:既能够自我保护又能够有利酶促底物反应进行。但是,Pcy A是否具备抑制某些超氧物氧化功能,需进一步鉴别。总之,克隆葛仙米Ns-Pcy A基因,为了解和运用葛仙米藻蓝蛋白辅基色素关键合成酶功能及提供了基础。

4 结论

本研究克隆葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-Pcy A,并在大肠杆菌中成功表达目的蛋白。序列和分子结构模拟分析显示,Ns-Pcy A为富含半胱氨酸蛋白,其氨基酸肽链主要包含α螺旋和β折叠等二级结构,并以其分别建构蛋白亲水外围与疏水核心,从而形成三面夹心式高级构型。研究结果为进一步深入研究和开发葛仙米藻蓝胆素细胞内合成提供了重要基础。