意大利蜜蜂amPGI基因的克隆与表达分析

欧阳霞辉,徐文凯,郑相相,彭 帅,刘丽霞

(西北民族大学 生命科学与工程学院,兰州 730030)

葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase,PGI)普遍存在于真核生物和原核生物中,是参与糖酵解途径的一种重要的多功能酶,主要通过转移碳位上的质子催化葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸的相互转换[1]。PGI根据行使功能的不同,又称神经细胞素(Neuroleukin,NLK)、自分泌运动因子(Autocrine mobility factor,AMF)和分化成熟调节因子(Differentation and maturation mediator,DMM)[2-3]。PGI作为一种非常保守的酶[4],不仅参与糖代谢,还在动物细胞中作为自分泌运动因子,促进肿瘤细胞增殖浸润,从而调节细胞分裂和生长因子活性[5-6]。由于PGI在生物体内行使多种功能,所以该酶的基因缺陷可引起多种疾病[7]。

自首次从兔肌肉中分离PGI以来,有关PGI的研究报道逐渐增加,研究对象广泛,如人类、鱼类、植物及微生物等[8]。有关哺乳动物PGI的研究报道显示,PGI与胚胎细胞和癌细胞的细胞增殖密切相关。Kugler等[9]研究发现PGI基因缺失会导致老鼠胚胎死亡。赵亮[10]研究证实PGI在白血病细胞中高表达,下调PGI基因后可抑制糖酵解途径并引发细胞凋亡。王芬等[11]干扰PGI在乳腺癌MCF-7细胞中的表达后,MCF-7细胞的糖代谢和细胞增殖被抑制,从而加快细胞凋亡。在昆虫中,对果蝇和桔小实蝇的初步研究发现,PGI是一种重要的糖酵解酶,参与昆虫生长发育过程中的能量代谢[12],同时还是几丁质生物合成途径中的关键酶之一[13-14],在几丁质的形成中起重要作用[15]。

尽管国内外学者对PGI已经作了比较详尽的研究,但有关昆虫PGI基因的研究报道依然较少,对昆虫PGI的了解有限,仍有很多问题尚待解决。本研究以重要的经济昆虫—意大利蜜蜂(Apis mellifera)为研究对象,对其PGI基因进行克隆和分析,并进一步检测该基因在意大利蜜蜂不同品级不同发育阶段的表达谱,明确该基因的分子结构特征和表达模式,以期为进一步阐明am PGI在意大利蜜蜂生长与发育过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 取样 意大利蜜蜂采自甘肃省兰州市五泉王氏养蜂场,采样如下:工蜂取第2天的卵(G-2),第3天孵化期幼虫(G-3),幼虫期第5、7、9、11天的幼虫(G-5、G-7、G-9、G-11),蛹期的预蛹(GY)、白眼蛹(G-B)、红眼蛹(G-H),羽化成虫(GC);雄蜂取第2天的卵(X-2),第3天孵化期幼虫(X-3),幼虫期第4、6、8、10、12天的幼虫(X-4、X-6、X-8、X-10、X-12),蛹期的预蛹(X-Y)、白眼蛹(X-B)、红眼蛹(X-H),羽化成虫(X-C);蜂王取第2天的卵(W-2),第3天孵化期幼虫(W-3),幼虫期第4、5、6、7天的幼虫(W-4、W-5、W-6、W-7),蛹期的预蛹(W-Y)、白眼蛹(W-B)、红眼蛹(WH),羽化成虫(W-C)。

1.1.2 试剂 Trizol购自Invitrogen公司;反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、克隆载体p MD18-T、大肠杆菌DH5α感受态细胞、TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)均购自大连宝生物工程公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自索莱宝(北京)有限公司;引物合成和DNA序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 采用Trizol法提取80～110 mg组织样品总RNA[16]。采用分光光度计测定RNA样品的浓度及OD260nm/280nm值,并通过琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量。用反转录试剂盒PrimeScriptRTMaster Mix(Perfect Real Time)将总RNA反转录为c DNA,于-20℃保存。

1.2.2 引物设计及扩增 根据GenBank中PGI已有同源序列(XM_623549.6),利用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1),以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系为:上、下游引物各0.2μL,EXTaq酶5μL,模板0.5μL,最后用dd H2O补足至10μL。PCR反应程序为:95℃预变性5 min,98℃变性10 s,50℃退火30 s,72℃延伸2 min 30 s,共30个循环,72℃延伸10 min,4℃保存。经琼脂糖凝胶鉴定的目的片段利用胶回收试剂盒回收,且与p MD18-T载体连接,转化至E.coliDH5α,接种于LB平板培养基上培养后,挑斑、摇菌,经PCR扩增验证目的基因的片段大小,提取重组质粒p MD18-T-amPGI,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测定,将正确的序列提交至GenBank。

1.2.3 序列分析 采用ORF finder搜索开放阅读框,翻译成氨基酸序列。采用DNAStar进行序列同源性比对,通过MEGA 5.0软件基于NJ法 构 建 系 统 进 化 树。采 用Protparam和ProtScale分析amPGI的理化性质及亲疏水性;利用SOPMA和SWISS-MODEL预测amPGI结构。采用Interpro预测amPGI的保守结构域;利用Motif Scan在线程序预测翻译后修饰位点。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析意大利蜜蜂PGI表达模式 以意大利蜜蜂β-actin(登陆号:NM_001185146.1)为内参基因[17](引物序列见表1),使用Line Gene9660 qPCR仪进行RT-qPCR检测。以意大利蜜蜂不同品级不同时期样品的cDNA为模板,每个样品设3个重复。实时荧光定量PCR反 应 体 系(20μL)为:TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)(2×)10 μL,上下引物各0.8μL,c DNA 2μL,RNase Free H2O 6.4μL;反应程序为:95℃预变性1 min,95℃变性10 s,60℃退火30 s,40个循环。采用2-△△Ct法进行基因相对表达量计算[18],应用SPSS 21进行单因素方差分析和多重比较,并利用GraphPad Prism 7软件绘图。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

2 结果与分析

2.1 amPGI基因的克隆

经RT-PCR扩增,最终获得一条1 674 bp的目的条带(图1),经克隆测序、比对鉴定,确定是意大利蜜蜂PGI基因序列,命名为amPGI,将序列提交GenBank,登录号为MK713970。该序列包含一个1 674 bp的开放阅读框,编码一个由577个氨基酸组成的蛋白质。

2.2 amPGI同源性分析与系统进化树构建

序列比对发现,意大利蜜蜂与大蜜蜂Apis dorsata(XP_006610643.1)、小蜜蜂Apis florea(XP_003690758.1)、美洲东部熊蜂Bombus impatiens(XP_003490330.1)、欧洲雄蜂Bombus terrestris(XP_003396233.1)、苜蓿切叶蜂Megachile rotundata(XP_003701061.1)、印度跳蚁Harpegnathos saltator(XP_011142877.1)、红火蚁Solenopsis invicta(XP_025997003.1)、小火蚁Wasmannia auropunctata(XP_011696577.1)、茶翅蝽Halyomorpha halys(XP_014282603.1)的PGI的氨基酸序列相似度分别为96.3%、96.0%、90.1%、90.1%、85.7%、82.4%、80.3%、79.9%、62.5%,可见意大利蜜蜂amPGI与大蜜蜂PGI的序列相似度最高(图2)。

基于NJ法对已报道的昆虫PGI序列进行系统发育分析,结果显示,意大利蜜蜂与大蜜蜂的亲缘关系最近,并与其他几种蜜蜂聚成一个大类,与茶翅蝽的关系比较远,这与序列比对的结果和物种的实际进化历程相符,说明PGI在进化过程中非常保守(图3)。

2.3 amPGI氨基酸序列理化特性、亲疏水性预测与分析

Protparam分析结果显示,amPGI分子质量为62.97 ku,等电点(PI)为7.73,不稳定指数为27.32,半衰期为30 h,同时含有57个负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)和58个正电荷氨基酸残基(Arg+Lys),为偏碱性的稳定蛋白。amPGI蛋白含有20种标准氨基酸,亮氨酸(Leu)含量最多(11.0%),半胱氨酸(Cys)含量最低,仅占0.7%。

ProtScale的分析结果表明,amPGI蛋白为亲水蛋白,且第324位的丙氨酸疏水性最强(Max=2.756),第445位的谷氨酸亲水性最强(Min=-2.767)(图4)。

2.4 amPGI蛋白结构功能预测与分析

2.4.1 结构预测与分析 使用在线软件SOPMA预测意大利蜜蜂amPGI蛋白的二级结构,其中α-螺旋(Alpha helix)占47.76%、β-转角(Beta turn)占6.82%、延伸链(Extended strand)占14.00%、无规卷曲(Random coil)占31.42%。利用SWISS-MODEL在线软件基于PDB数据库对amPGI进行同源建模(模板为4wmj.1.A),获得amPGI蛋白三级结构模型(图5)。由三级结构可知,α-螺旋占主导地位,与二级结构预测结果一致。

2.4.2 保守结构域预测与分析 利用Ex PASy的inter Pro在线程序预测意大利蜜蜂amPGI蛋白的保守结构域,结果显示该蛋白属于糖磷酸异构酶家族,为葡萄糖-6-磷酸异构酶,有2个保守结构域,其结构域位点分别为127～289、337～528,表明该蛋白在生物进化过程中高度保守。同时含有10个催化核心的活性位点(图5),氨基酸位置分别为161I、163G、164S、213S、214K、215T、218T、275G、357Q、361E。

2.4.3 翻译后修饰位点预测与分析 Motif Scan分析特定位点结果显示:amPGI含有5个N-糖基化位点;1个c AMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点;4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;7个N-豆蔻酰化位点;4个蛋白激酶C磷酸化位点。

2.5 amPGI实时荧光定量PCR

amPGI基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期均有表达,且差异显著(P＜0.05)。在工蜂发育的各个时期中(图6-A),卵前期和蛹期该基因表达量较低,幼虫期5日龄其表达量最高,从卵期2日龄到幼虫期5日龄和从蛹期到成虫期其表达量逐渐增加。在雄蜂发育的各个时期中(图6-B),卵期和蛹期该基因表达量较低,成虫期其表达量最高,从卵期2日龄到幼虫期4日龄和从红眼蛹期到成虫期其表达量逐渐增加。在蜂王发育的各个时期中(图6-C),卵前期和蛹期该基因表达量较低,幼虫期6日龄其表达量最高,从卵期2日龄到卵期3日龄其表达量逐渐增加,且幼虫期4日龄与卵期3日龄其表达量无差异,同时从蛹期到成虫期其表达量也逐渐增加。

意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期该基因表达情况对比分析结果表明(图7),不同品级从卵期到幼虫期第1天(卵的孵化阶段)、从蛹期到成虫期(蛹的羽化阶段)该基因表达量都急剧增加。此外,不同品级卵前期和蛹期该基因表达量相对稳定。

3 讨论

PGI既催化糖代谢,又参与几丁质(也称甲壳素)合成,其中糖代谢提供机体所需的大量能量,几丁质则在昆虫外骨骼的形成中发挥着重要作用[15,19-20]。PGI是由单一基因位点编码的关键蛋白酶,该基因缺失或功能异常会导致机体死亡,如该基因缺失可导致老鼠胚胎死亡[9]。目前对PGI的研究主要集中于高等动物、鱼类、植物以及微生物[21],而在蜜蜂等昆虫类动物中还鲜有报道。

在桔小实蝇中,PGI基因高表达于脂肪体和马氏管[15],而脂肪体是昆虫中大分子有机物(糖类、蛋白类)代谢的关键位置[22],另外发现,PGI还是节肢动物中一种重要的适应性分子标记[23]。本研究克隆得到意大利蜜蜂am PGI基因,其编码区全长1 674 bp,编码557个氨基酸,且amPGI与大蜜蜂的亲缘关系最近,序列相似度达到96.3%。半衰期越长蛋白结构越稳定,不稳定指数小于40为稳定蛋白[24],且α-螺旋和β-转角化学键键能较高,不易变性,能够维持蛋白的高级结构,意大利蜜蜂amPGI蛋白半衰期为30 h,不稳定指数小于40,同时α-螺旋和β-转角总占比达54.58%,说明amPGI是一种稳定蛋白。已知蛋白质翻译后修饰有400多种[25],是调节蛋白质结构功能的重要方式[26],其中磷酸化和去磷酸化过程调控着细胞的增殖分化和新陈代谢[27],am PGI存在9个磷酸化位点,同时保守结构域发挥着重要作用,是蛋白的核心,2个保守结构域内包含10个催化核心的活性位点,且161I、163G、164S、213S和214K处在疏水区域的分子内部,说明其在意大利蜜蜂的发育过程中可能与细胞增殖分化的能量代谢有关。

为进一步探讨amPGI在意大利蜜蜂生长发育过程中的生物学功能,检测并分析该基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期的表达情况。幼虫期和成虫期是昆虫运动、营养转化和快速发育的关键阶段,且有研究发现果蝇幼虫的生长依赖于一种类似哺乳动物瓦氏效应的有氧糖酵解形式[12],意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期的幼虫期和成虫期该基因表达量大体上都比卵前期和蛹期高,推测这两个阶段利用糖酵解途径合成所需的大量能量,这与陈力[15]研究结果颇为相似。此外,桔小实蝇不同发育时期PGI基因的表达与几丁质含量变化具有显著线性相关性[15],推测其利用几丁质合成途径合成生长发育所需的几丁质。不同发育时期转变时细胞活力会迅速增强[28],对ATP、氨基酸和核苷酸等大分子物质需求量增加,从而会提高糖酵解和几丁质合成速率,不同品级卵的孵化和蛹的羽化过程中该基因表达量都急剧增加,以适应机体生长发育过程中的代谢需求。

工蜂属于生殖器官发育不完善的雌性,相比雄蜂和蜂王,工蜂成虫中amPGI可能主要参与几丁质的合成。工蜂发育的各个时期中成虫期该基因表达量较高,但明显低于雄蜂和蜂王成虫期的表达。雄性原始生殖细胞的增殖、精子的超活化以及精卵结合都受益于糖酵解[29],且抑制糖酵解及其相关蛋白酶的活性会影响雄性原始生殖细胞的增殖,并导致精子功能异常[30-31],在雄蜂发育的各个时期中成虫期该基因高表达,推测糖酵解在雄蜂精巢的成熟过程中发挥着重要作用。卵母细胞可吸收来自于卵丘细胞糖酵解产生的丙酮酸,并以此作为能量物质促进卵母细胞的分裂和卵子的形成[32-33],且体外培养的高表达糖酵解相关酶的卵子质量更佳[34],在蜂王发育的各个时期中成虫期该基因表达量与雄蜂成虫期相当,由此可知am PGI基因在蜂王卵巢及卵子的发育过程中具有重要作用。

本研究预测分析amPGI蛋白的理化性质及生物学功能,同时检测并分析am PGI基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期的表达情况,以期为进一步阐明amPGI在意大利蜜蜂生长与发育过程中的功能奠定基础,为糖酵解、几丁质合成等相关通路的研究提供理论依据。