结肠癌中TMCO1、CALR的表达及对转移的影响

齐顺利，赵团结，于晓倩，孙 平，刘红刚

2020年全球癌症统计报告指出，结直肠癌的发病率仅次于乳腺癌和肺癌，位居第3位，其病死率仅次于肺癌，位居第2位，且结肠癌的发病率和病死率呈年轻化趋势[1-2]。虽然近年来临床获得大量防治结肠癌转移的研究成果，但寻找特异性治疗靶点仍是防治转移的关键。

跨膜和卷曲螺旋结构域1(transmembrane and coiled-coil domains 1, TMCO1)是一种新型内质网钙离子通道蛋白，其基因的缺失或蛋白表达异常将会引起内质网Ca2+稳态失衡和信号异常，引发内质网应激和Ca2+信号传导紊乱，从而导致肿瘤的发生[3-4]。钙网蛋白(calreticulin, CALR)是一种存在于内质网中高度进化保守的钙结合蛋白，参与细胞的各种生理和病理过程。越来越多的研究发现，CALR表达与不同类型肿瘤细胞的增殖和转移有关[5-6]。目前，TMCO1、CALR在结肠癌中的作用机制仍不清楚。本实验拟通过人结肠癌组织标本和细胞模型，阐述TMCO1和CALR在结肠癌组织中的表达水平，以及明确TMCO1对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响，为寻找新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年1月～2021年1月北京市肛肠医院存档的59例低～中分化结肠癌根治术标本及对应的癌旁组织样本。患者术前均未接受中医治疗、新辅助化疗以及生物靶向等治疗。本实验通过北京市肛肠医院科研伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 细胞与试剂结直肠癌HCT116细胞株购自上海中乔新舟公司，TMCO1抗体购自武汉华美公司，CALR抗体购自武汉三鹰公司，N-cadherin、E-cadherin、β-actin抗体均购自北京博奥森公司，Lipofectamine 3000购自赛默飞世尔公司，DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素溶液均购自GIBCO公司，Transwell小室购自Corning公司，vimentin、荧光二抗、免疫组化二抗均购自北京中杉金桥公司，1%结晶紫染液购自北京索莱宝公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 结肠癌和癌旁组织常规组织脱水、石蜡包埋，连续切片，脱蜡至水，EDTA(pH 8.0)抗原修复，滴加一抗TMCO1(1 ∶100)、CALR(1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，滴加二抗工作液，37 ℃孵育1 h，PBS震荡清洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水、封片，400倍光镜下观察蛋白表达情况。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，测量TMCO1、CALR阳性细胞的平均吸光度(A)值，以间接反映TMCO1、CALR蛋白表达量，重复3次取平均值。

1.3.2细胞培养和转染 配置细胞完全培养基(含10%FBS、1%双抗、DMEM高糖)，在37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每2～3天传代1次。取对数生长期细胞，1×105个/孔接种于6孔板，将细胞分为对照组、Lip 3000组和TMCO1 siRNA组。当细胞融合度达70%～80%时，参照Lip 3000试剂盒说明书步骤根据实验分组进行转染。其中，TMCO1 siRNA序列(上游5′-GAGAUCUAUCAAUGGUUCG AATT-3′，下游5′-UUCGAACCAUUGAUAGAUCUCT T-3′)由上海生工公司合成。转染48 h后收集所有分组细胞，Western blot法检测TMCO1 siRNA转染效果。

1.3.3免疫荧光 各组细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定10 min，0.5%Triton X-100室温通透20 min，PBS漂洗3次，5%BSA封闭30 min，加一抗TMCO1(1 ∶100)、CALR(1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，避光荧光二抗孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI核染5 min，封固后在荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.4Western blot法 取各组细胞，PBS冲洗2次，加入500 μL细胞裂解液，吸至离心管中，12 000 r/min离心20 min后取上清液，BCA法测定总蛋白浓度。100 ℃沸水浴5 min使蛋白变性、电泳、转膜，10%脱脂奶粉封闭2 h，加一抗TMCO1(1 ∶500)、CALR(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃过夜，次日复温1 h，加二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL暗室曝光显影。以β-actin为内参，采用Image J图像分析软件进行灰度值分析，灰度值=目的条带/β-actin。

1.3.5细胞划痕实验 取对数生长期细胞，按每毫升2×105个细胞，每孔500 μL细胞悬液接种于6孔板中，培养过夜，用200 μL枪头在培养板内划线，PBS清洗3次，加入无血清培养基，每组设3个复孔，培养48 h后在显微镜下观察并拍照，利用Image J图像分析软件进行分析。

1.3.6Transwell检测 细胞无血清培养24 h，胰蛋白酶消化，培养基重悬至细胞浓度为每毫升1×105个，将Transwell上室加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含10%血清的完全培养基，37 ℃ 5%CO2培养48 h，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色20 min，用棉签擦去上层细胞，随机取中央及四周5个视野，倒置显微镜下观察、拍照并计数，实验重复3次。

1.3.7内质网红色荧光探针检测 去除细胞培养液，HBSS溶液洗涤，加入配置好的ER-Tracker Red工作液，37 ℃孵育15 min，细胞培养液洗涤2次，10%中性福尔马林37 ℃固定2 min，PBS清洗3次，每次5 min，滴加抗荧光淬灭封片液，荧光显微镜下封固并观察，实验重复3次。

2 结果

2.1 结肠癌和癌旁组织中TMCO1、CALR蛋白的表达结肠癌组织中TMCO1和CALR蛋白表达较癌旁组织增高，差异有统计学意义(t=-8.519、-7.256，P均<0.01，图1)。

图1 结肠癌和癌旁组织中TMCO1、CALR蛋白表达水平：与癌旁组织相比，*P<0.05

2.2 Western blot法检测TMCO1 siRNA干扰效果应用Western blot法检测结肠癌HCT116细胞经TMCO1 siRNA干扰后TMCO1蛋白表达情况，与对照组相比，TMCO1 siRNA干扰组TMCO1蛋白表达水平显著降低(F=232.118，P<0.001，图2)。

图2 Western blot法检测TMCO1 siRNA干扰效果

2.3 细胞划痕实验检测TMCO1对HCT116细胞迁移能力的影响对照组、Lip 3000组和TMCO1 siRNA组0 h划痕距离差异无统计学意义(F=0.176，P>0.05)。TMCO1 siRNA组48 h划痕距离显著长于对照组和Lip 3000组，差异具有统计学意义(F=23.307，P<0.01，图3)。

图3 细胞划痕实验检测TMCO1对结肠癌HCT116细胞迁移能力的影响：与对照组比较，*P<0.05；与Lip 3000组比较，#P<0.05

2.4 Transwell实验检测TMCO1对HCT116细胞侵袭能力的影响TMCO1 siRNA组(44.67±6.51)穿过Transwell小室的细胞数量明显低于对照组(190.33±16.56)和Lip 3000组(184.67±14.98)，差异具有统计学意义(F=113.265，P<0.001，图4)。

图4 Transwell实验检测TMCO1对结肠癌HCT116细胞侵袭能力的影响

2.5 免疫荧光检测HCT116细胞TMCO1、CALR蛋白表达水平与对照组和Lip 3000组相比，TMCO1 siRNA组HCT116细胞TMCO1、CALR蛋白荧光强度显著减少，差异有统计学意义(F=153.078、153.039，P均<0.001，图5)。

图5 免疫荧光检测结肠癌HCT116细胞中TMCO1、CALR蛋白表达水平：与对照组比较，*P<0.05；与Lip 3000组比较，#P<0.05

2.6 Western blot法检测TMCO1对HCT116细胞CALR、vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平的影响Western blot检测结果显示，TMCO1 siRNA组CALR、TMCO1、vimentin、N-cadherin蛋白表达水平较对照组和Lip 3000组显著降低，而E-cadherin蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(F=66.4396、69.806、170.146、58.713、283.747，P均<0.001，图6)。

图6 Western blot检测结肠癌HCT116细胞TMCO1、CALR、vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平：与对照组比较，*P<0.05；与Lip 3000组比较，#P<0.05

2.7 内质网探针检测TMCO1对HCT116细胞内质网氧化应激水平的影响TMCO1siRNA组内质网探针荧光强度较对照组和Lip 3000组显著降低，差异有统计学意义(F=42.003，P<0.001，图7)。

3 讨论

结肠癌是我国常见的消化道肿瘤之一，结肠癌细胞的转移和侵袭是导致我国结肠癌患者生存率低、病死率高的主要因素。所以，探索敏感性、特异性靶点成为防治结肠癌转移的关键。

Ca2+作为细胞的第二信使，参与机体细胞代谢、细胞增殖和死亡、蛋白质磷酸化、神经递质和激素释放、基因转录等多种生理活动[7-8]。Ca2+浓度的异常升高可以激活癌细胞的活性，促进癌细胞的增殖和迁移[9]。TMCO1作为一种新型的内质网Ca2+通道蛋白，其基因缺失或蛋白表达异常将会引起内质网Ca2+稳态失衡和信号异常，导致肿瘤的发生。Li等[10]研究发现，TMCO1能够通过抑制AKT信号通路抑制膀胱尿路上皮癌的增殖和迁移，表明TMCO1是新型的抑癌因子，抑制其蛋白表达可影响患者预后。Chen等[11]研究发现，TMCO1可以促进肺腺癌的侵袭和迁移，抑制TMCO1表达水平肺腺癌细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制。TMCO1表达可能在不同的肿瘤和癌细胞中具有不同的功能，这可能与肿瘤细胞类型特异性差异有关。本实验通过干扰TMCO1表达，可显著抑制结肠癌HCT116细胞的侵袭和迁移能力，并且我们推测其可能与CALR蛋白相关。

CALR蛋白在肿瘤进展中发挥重要作用。诸多研究表明，CALR在结直肠癌、胃癌、乳腺癌中表达显著升高，其表达水平与临床分期和淋巴结转移呈正相关[12-14]。Harada等[15]报道CALR高表达与口腔鳞状细胞癌患者TNM分期、总生存率以及预后不良有关，CALR可作为衡量口腔鳞状细胞癌预后的重要标志物。本实验结果表明，人结肠癌组织中TMCO1、CALR蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织，提示TMCO1、CALR高表达可能与结肠癌的发生、发展密切相关。

为进一步验证，本实验检测TMCO1对CALR表达的影响，发现TMCO1 siRNA组中CALR表达显著降低，提示TMCO1 siRNA抑制结肠癌侵袭和迁移过程与调控CALR表达水平相关。本实验通过内质网荧光探针发现，转染TMCO1 siRNA可显著降低探针强度，作者推测TMCO1可能通过调控内质网氧化应激促进结肠癌的发生。本实验现阶段并未验证，后续将进一步深入研究。此外，本实验亦发现干扰TMCO1表达后EMT相关标志物蛋白vimentin、N-cadherin蛋白表达水平明显降低，而E-cadherin蛋白表达水平明显升高。这提示，TMCO1的促癌作用可能与调控vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达有关。Chen等[11]的研究亦发现，在肺腺癌中抑制TMCO1表达，vimentin、N-cadherin表达水平明显降低，E-cadherin表达水平明显升高，从而导致迁移能力显著降低，与本实验结果一致。

综上所述，结肠癌组织中TMCO1、CALR蛋白表达水平显著升高。干扰TMCO1表达后，HCT116细胞侵袭和迁移能力显著降低，其作用机制可能与CALR及内质网氧化应激水平以及EMT相关标志物蛋白显著相关。