IDO抑制剂LPM3480226联合不同化疗药物抗小鼠结肠癌CT26

李晓鹏,郑 爽,刘塑杰,田京伟,杜广营

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台 264005)

免疫逃逸是指肿瘤通过多种机制逃避免疫系统的识别和攻击,促进肿瘤细胞生长和转移,是肿瘤存活和进展的重要策略[1-2]。吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO,EC1.13.11.42),是一种含亚铁血红素的酶,广泛分布于人和其他哺乳动物除肝脏以外的组织中。IDO通过色氨酸在犬尿氨酸的分解代谢起关键作用[3],IDO可通过多种机制介导肿瘤免疫逃逸,已经成为抗肿瘤免疫治疗的新靶点。已经有多个IDO抑制剂进入至临床试验阶段,其中进展最快的BMS-986205(BMS公司)正在开展膀胱癌的phase 3研究[4-5]。然而,动物试验研究结果显示,IDO抑制剂单用时抗肿瘤作用较弱,肿瘤抑制率约30%～50%[6]。因此,有必要寻求提高IDO抑制剂临床抗肿瘤作用的途径,将IDO抑制剂与其他作用机制的抗肿瘤药物如化疗药物联合使用是其中重要策略之一。

紫杉醇是第一个应用于肿瘤化疗的紫杉烷家族药物,通过促进微管蛋白聚合抑制解聚,致使快速分裂的肿瘤细胞终止于有丝分裂G2M期而死亡,临床上主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小细胞肺癌的一线和二线治疗[7-9]。伊立替康及其活性代谢物SN-38可与拓扑异构酶I-DNA复合物结合,从而阻止断裂单链的再连接,引起DNA双链断裂,主要用于成人转移性大肠癌的治疗[10]。力扑素是南京绿叶思科药业公司生产的紫杉醇脂质体,临床用于乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的化疗治疗。氟尿嘧啶是以抗代谢物而起作用[11],在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶脱氧核苷酸后,通过阻断脱氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶转化为胸苷酸,而干扰DNA的合成,临床上广泛用于多种肿瘤的化疗治疗如肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等。

LPM3480226是山东绿叶制药有限公司开发的小分子IDO抑制剂,结构式见图1,正在中国开展临床一期试验,注册登记号为CTR20182328。本研究以小鼠结肠癌CT26荷瘤小鼠为模型,观察LPM3480226联合紫杉醇、伊立替康、力扑素、氟尿嘧啶等常用化疗药物的抗肿瘤作用,为LPM3480226的开发以及临床研究方案提供理论基础和依据。

图1 LPM3480226的化学结构式Fig.1 Chemical structure of LPM3480226

1 实验材料

1.1 细胞株与动物

小鼠结肠癌细胞CT26. WT,由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供,使用RPMI-1640培养基,含10%胎牛血清,于37 ℃,5% CO2的环境中培养,隔天换液1次,每2～3 d传代,按1∶2～1∶5比例传代。

BALB/c小鼠,雄性,体重16～20 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2014-0004,动物饲养于SPF级(无特定病原体)环境中,温度21±2 ℃,湿度30%～70%,人工照明,昼夜12 h交替。所有动物相关的实验操作均经烟台大学实验动物伦理委员会审核并批准。

1.2 供试品与主要试剂

LPM3480226,白色或类白色粉末,山东绿叶制药有限公司生产;HPLC纯度大于99.7%,分子式为C12H12BrFN6O3S,相对分子质量为419.23。LPM3480226溶液配制:加入适量预先配制的20% Solutol溶液,50～60 ℃超声至溶液澄清,再用溶剂定容至所需体积;配制成不同的浓度,配制后室温遮光保存。

紫杉醇注射液,10 mL/60 mg/瓶,海口市制药厂有限公司生产,用生理盐水注射液稀释至所需浓度,现用现配。

注射液用紫杉醇脂质体(力扑素®),10 mL/30 mg/瓶,南京绿叶思科药业有限公司生产,使用时向瓶内加入适量5%葡萄糖注射液,在紫杉醇脂质体专用振荡器上振摇5 min,然后定容至所需体积,再稀释至所需浓度,给药前再振摇10 min。

注射用盐酸伊立替康(开普拓®),2 mL/40 mg/瓶,辉瑞制药生产,使用时吸取一定量原液,用生理盐水注射液稀释至所需浓度,现用现配。

氟尿嘧啶注射液(海普®),10 mL/0.25 g/瓶,上海旭东海普药业有限公司生产,使用时吸取一定量原液,用生理盐水注射液稀释至所需浓度,现用现配。

Kolliphor®HS15(Solutol)购自SIGMA公司,生理盐水购自山东齐都药业有限公司,葡萄糖注射液购自石家庄四药有限公司,Matrigel@基质胶购自美国BD Biosciences公司。

2 实验方法

2.1 CT26荷瘤小鼠制备

取对数生长期的CT26细胞,收集、重悬至无血清培养基中,调整细胞浓度为1×106个/mL,向细胞悬液中加入等体积的Matrigel,使细胞的终浓度为5×105个/mL。超净工作台中,于每只小鼠肩胛处皮下接种0.2 mL肿瘤细胞悬液,接种量为1×105个/只。待瘤快长至500～1000 mm3时,剥出瘤块,剪刀剪碎,用皮埋植入穿刺针(直径1.2 mm)接种至小鼠背部肩胛处皮下,制备CT26小鼠移植瘤模型。游标卡尺测量肿瘤最大直径(a)和最小直径(b),根据公式V=0.5×a×b2,计算肿瘤体积,待肿瘤体积长至100 mm3时,进行随机分组,开始试验。

2.2 剂量设计

前期荷瘤小鼠结肠癌CT26模型剂量依赖性研究结果显示,LPM3480226在200 mg/kg时,肿瘤抑制作用最强,抑制率为40%左右。本实验室药效试验研究背景资料显示,紫杉醇、力扑素、氟尿嘧啶、伊立替康的最大耐受剂量分别约为20、40、40、50 mg/kg。因此,本实验中,LPM3480226的给药剂量设为200 mg/kg,每天2次灌胃给药;紫杉醇、力扑素、氟尿嘧啶、伊立替康的给药剂量分别设为20、40、40、50 mg/kg,每周2次静脉注射给药。

2.3 实验分组与给药

待瘤块长至平均体积约100 mm3时开始分组,分组当天开始给药,定义为第1天,本实验共分为10个组,每组8只动物,给药体积为0.1 mL/10 g,LPM3480226的给药剂量设为200 mg/kg,每天2次灌胃给药,紫杉醇、力扑素、氟尿嘧啶、伊立替康的给药剂量分别设为20、40、40、50 mg/kg,每周2次静脉注射给药,连续给药11 d,且停止给药后继续观察小鼠的体重、肿瘤体积4 d,动物分组及给药详见表1。

表1 PM3480226联合不同化疗药物抗小鼠CT26研究动物分组与给药(n=8)Tab.1 Antitumor effect of combined LPM3480226 and chemotherapy drugs in CT26 carcinoma-bearing mice: grouping an administration (n=8)

2.4 观察指标

2.4.1 动物体重及死亡 实验期间每天观察动物死亡,每2 d测量1次各组小鼠体重。实验第15天,最后1次称重,以分组时动物体重为基础,计算体重变化百分率。

2.4.2 肿瘤体积 实验期间,每2 d测量1次各组动物的肿瘤体积(V)。游标卡尺测量肿瘤最大直径(a)和最小直径(b),根据公式V=0.5×a×b2计算肿瘤体积。根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线,动态观察受试药物的抗肿瘤效应。

2.4.3 肿瘤重量 实验第15天,小鼠经脱颈椎实施安乐死,剥离瘤块并称重。根据肿瘤重量,计算每组的平均肿瘤重量MTV。相对肿瘤抑制率TGI(%):TGI=1-T/C。T/C为相对肿瘤增值率,即在某一时间点,治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组瘤重。

参考文献[12],依据肿瘤重量分别计算LPM3480226与紫杉醇、力扑素、伊立替康、氟尿嘧啶联合指数CI=W联合/(WLPM3480226×W(PTC/LPS/CPT/FU)),W联合为LPM3480226+紫杉醇、LPM3480226+力扑素、LPM3480226+伊立替康、LPM3480226+氟尿嘧啶的平均瘤重与对照组平均瘤重的比值,WLPM3480226为LPM3480226单用组与对照组平均瘤重的比值,W(PTC/LPS/CPT/FU)为紫杉醇、力扑素、伊立替康、氟尿嘧啶单用组平均瘤重与对照组平均瘤重的比值。CI值<1表示有协同作用,CI值=1表示有相加作用,CI值> 1表示有拮抗作用。

2.5 统计分析

3 实验结果

3.1 荷瘤小鼠动物体重

各给药组均未出现动物死亡。体重结果如图2和表2所示,实验期间,LPM3480226组、紫杉醇组、力扑素组、伊立替康组动物体重在各时间点与对照组均无显著差异(P>0.05);氟尿嘧啶组动物体重在第3至第7天显著低于对照组(P<0.05);LPM3480226+紫杉醇组在第5至第9天,LPM3480226+力扑素组在第7至第13天,LPM3480226+伊立替康组在第5、9、13天,LPM3480226+氟尿嘧啶组在第5至第13天,动物体重显著低于对照组(P<0.05),这些组别在这些时间点的动物体重降低幅度不大,多小于10%。第11天最后一次给药结束后,各给药组动物体重开始恢复,至实验结束时(第15天),各给药组和对照组的动物平均体重和分组时的自身体重相比变化不大(-0.5%～6%)。

LPM3480226经灌胃给药,200 mg/kg,BID。四种化疗药物均经静脉给药,BIW。给药后每2 d测量1次动物体重,数据以表示(n=8);*P<0.05,与对照组比较。图2 LPM3480226联合不同化疗药物对CT26荷瘤小鼠体重的影响Fig.2 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on body weight of CT26-bearing mice

表2 LPM3480226联合不同化疗药物对CT26荷瘤小鼠体重及瘤重的影响(n=8)Tab.2 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on body weight and CT26 xenografts (n=8)

3.2 肿瘤体积

各组肿瘤生长曲线如图3所示,LPM3480226组在给药后第5天开始肿瘤体积显著小于对照组(P<0.05);紫杉醇组、力扑素组在给药后第5天开始,伊立替康组、氟尿嘧啶组在给药后第3天开始,肿瘤体积均显著小于对照组(P<0.05);LPM3480226+紫杉醇组、LPM3480226+力扑素组、LPM3480226+伊立替康组在给药后第5天开始,LPM3480226+氟尿嘧啶组在药后第3天开始,肿瘤体积均显著小于对照组(P<0.05)。在实验后期(第13至第15天),LPM3480226+力扑素、LPM3480226+伊立替康和LPM3480226+氟尿嘧啶各组动物的平均肿瘤体积均小于LPM3480226单用组(P<0.05),同时也小于化疗药单用组(P<0.05),而LPM3480226+紫杉醇的肿瘤体积与单用组无显著差异(P>0.05)。

LPM3480226经灌胃给药,200 mg/kg,BID。四种化疗药物均经静脉给药,BIW。给药后每2天测量1次肿瘤体积,数据以表示(n=8)。*P<0.05,和对照组比较;#P<0.05,与LPM3480226组比较;@P<0.05,与力朴素组比较;&P<0.05,与伊立替康组比较;＄P<0.05,与氟尿嘧啶组比较。图3 LPM3480226联合不同化疗药物对CT26移植瘤体积的影响Fig.3 Effects of combinantion LPM3480226 and different chemotherapy drugs on CT26 tumor volume

3.3 肿瘤重量及抑制率

实验结束时,各给药组的平均肿瘤重量均显著小于对照组(P<0.05)(图4)。LPM3480226+紫杉醇组肿瘤重量显著小于LPM3480226组(P<0.05),但与紫杉醇组相比较不具有统计学意义(P>0.05),肿瘤重量抑制率分别为54.1% vs 30.6%和42.3%。LPM3480226+伊立替康组、LPM3480226+氟尿嘧啶组、LPM3480226+力扑素组的肿瘤重量均显著小于LPM3480226组(P<0.05),同时也显著小于相应化疗药物单用组(P<0.05)。LPM3480226+力扑素组、LPM3480226+伊立替康组、LPM3480226+氟尿嘧啶组肿瘤重量与相应化疗药物单用组的抑制率分别为61.5% vs 38.8%,55.1% vs 36.8%, 78.8 % vs 53.6%,抑制率提高20%以上。根据肿瘤重量计算LPM3480226和紫杉醇、力扑素、伊立替康、氟尿嘧啶的CI值分别为1.14、0.90、1.02、0.66,其中力朴素和氟尿嘧啶的CI值小于1,且力朴素和氟尿嘧啶联用组肿瘤重量显著小于单用组,提示LPM3480226和力朴素、氟尿嘧啶联用具有一定协同效应。

LPM3480226,灌胃给药,200 mg/kg,BID;紫杉醇、力扑素、伊立替康、氟尿嘧啶静脉给药,给药剂量分别为20、40、50、40 mg/kg,BIW。数据以表示(n=8)。*P<0.05,与对照组比较;#P<0.05,与LPM3480226组比较;@P<0.05,与力扑素组比较;&P<0.05,与伊立替康组比较;＄P<0.05,与氟尿嘧啶组比较。图4 LPM3480226联合不同化疗药物对CT26移植瘤重量的影响Fig.4 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on CT26 tumor weight

4 讨论与结论

临床前研究结果显示,IDO抑制剂能有效提升PD-1等免疫检查点药物的抗肿瘤作用,已经成为肿瘤联合用药研究的主流方向[13],但IDO抑制剂与化疗药物的联合使用未见系统报道。本研究采用CT26荷瘤小鼠模型考察了IDO抑制剂LPM3480226联合紫杉醇、力扑素、伊立替康、氟尿嘧啶等常用化疗药物的抗肿瘤作用。LPM3480226与各化疗药物联用时,对荷瘤小鼠体重影响较小,提示出联合用药具有较好的耐受性;LPM3480226可不同程度地显著增强紫杉醇、伊立替康、力扑素、氟尿嘧啶等化疗药物的抗肿瘤作用。LPM3480226与不同化疗药物联用的抗肿瘤增强作用机制并不明确,推测可能机制如下:抗癌药物可诱导癌细胞凋亡,有利于淋巴细胞浸润,同时释放更多肿瘤抗原,可增强IDO抑制剂对T细胞的活化作用,改善肿瘤免疫微环境,上述因素协同作用,产生较强的抗肿瘤活性。

综上,LPM3480226与化疗药物紫杉醇、力扑素、伊立替康以及氟尿嘧啶联用时具有较好的耐受性,可提高化疗药物的抗肿瘤作用,支持在临床试验中进一步考察LPM3480226与上述化疗药物联用的抗肿瘤作用。