异甘草素改善RAW 264.7细胞线粒体生物发生抑制LPS诱导的炎症反应

赵秀荣,侯绍郅,皇甫通,何 杰,李 刚,马成俊,石 慧,王振华

(烟台大学生命科学学院,线粒体与健康衰老研究中心,山东 烟台 264005)

机体内氧分子经单电子逐步还原生成的活性氧(ROS)可作为初始信号,激活非特异性免疫系统,在组织损伤修复及杀灭病原体过程中发挥重要作用[1]。但剧烈炎症反应生成的过量ROS可致各组织细胞氧化应激损伤,被认为是机体衰老和老年性疾病发生的重要病理基础[2]。线粒体作为真核细胞氧代谢的关键细胞器,在调控细胞增殖、分化和凋亡等命运中发挥重要作用,源于线粒体ROS在维持其稳态方面至关重要[3]。

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为toll样受体4(TLR4)细胞外主要配体,与TLR4结合启动免疫应答,介导巨噬细胞活化,并激活其在胞浆内的下游信号传导途径:NF-κB和MAPKs等,导致大量细胞炎症因子(TNF-α、NO)、ROS以及RNS的过量产生[4-5]。ROS的产生主要发生在线粒体,LPS诱导免疫细胞刺激TNF-α的产生进而驱动线粒体ROS的生成,氧化剂也参与了炎症性线粒体损伤[6]。线粒体DNA位于产生ROS的电子传递复合物附近,由于缺乏保护性组蛋白,易受到外界氧化应激的影响而发生损伤[7],进而干扰线粒体转录和OXPHOS蛋白合成,损害线粒体呼吸能力,导致线粒体基因表达和功能的改变,进一步影响线粒体生物发生过程[8]。

异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL,结构式如图1)是传统中药甘草中所含的一种查尔酮类化合物,具有优异的抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性[9-11],但其确切的生物学机制仍待探究。本研究采用LPS诱导体外培养RAW 264.7巨噬细胞的炎性模型,考察了ISL的抗炎作用,探讨了ISL抗炎作用与维持线粒体稳态的关系,为甘草传统应用提供了新的依据。

图1 ISL结构式Fig.1 The structure of ISL

1 材 料

1.1 实验细胞系

RAW 264.7小鼠巨噬细胞系由烟台大学药学院惠赠,高糖DMEM培养基(Gibco)、10% FBS血清(Gibco)、5 % CO2在37 ℃恒温培养箱中培养,细胞融合度达到80%左右进行传代培养以及后续实验操作。

1.2 仪器与设备

CO2恒温培养箱(日本三洋电器集团);生物超净台(苏州净化设备有限公司);倒置相差显微镜(香港Motic公司);多功能酶标仪(Molecular Devices Corporation);流式细胞仪(杭州艾森公司);Micro 21R高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific Inc);数显恒温水浴锅(江苏省金坛市科兴仪器厂);电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);MH-2微孔板孵育振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);蛋白电泳仪器(美国 BIO-RAD公司);Tanon 5500凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);7500fastReal-TimePCR(Applied Biosystems)。

1.3 材料与试剂

ISL、LPS、MTT粉末(美国Sigma公司);蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA);BCA蛋白定量试剂盒、NAC、NO试剂盒、TNF-α测定试剂盒(上海Beyotime公司);ATP测定试剂盒(上海Beyotime公司);mito-TEMPO、mito-SOX、mito-Tracker Green、DCFH-DA探针(美国 Sigma 公司);Trizol试剂(Ambion/Invitrogen);M-MLV Reverse Transcriptase(Promega);M-MLV RT 5×Buffer(Promega);SYBR®Premix Ex TaqTMII(TaKara Bio INC);β-actin一抗、iNOS一抗、Drp1一抗、Mfn1/2一抗、PGC-1α一抗、NRF1一抗和Tfam一抗(美国CST公司);HRP耦联山羊抗兔IgG(美国Santa Cruz Biotechnology公司)。

2 方 法

2.1 实验分组及药物处理

2.1.1 ISL干预实验 设置三组:对照组(含有等量的溶剂对照)、模型组(LPS处理)、ISL组(5,10,20 μmol/L ISL处理)。

2.1.2 抑制剂干预实验 设置五组:对照组(含有等量的溶剂对照)、模型组(LPS处理)、ISL组(5,10,20 μmol/L ISL处理)、抑制剂处理组(包括NAC、Mito-tempo、Cccp 抑制剂)、抑制剂与ISL联用组(三种抑制剂分别与5,10,20 μmol/L ISL共处理,抑制剂提前30 min预处理)。

2.2 细胞活力测定

细胞按照8×104个/mL每孔100 μL接种于96孔板,5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养过夜。加入不同浓度含ISL的培养基,继续培养至24 h。处理结束后,弃原培养液,每孔加入100 μL含10% MTT(5 mg/mL)DMEM培养液,培养箱培养4 h,然后小心吸弃含MTT体系,每孔加入150 μL DMSO溶液,水平震荡15 min,酶标仪570 nm波长下测定吸光度A570。细胞存活率=实验组A570/对照组A570×100%。

2.3 Griess法测定NO浓度

细胞按照1×106个/mL每孔100 μL接种于96孔板,5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养细胞贴壁后,按“2.1.1”方法分组处理细胞,孵育24 h。Griess法测定细胞上清液NO浓度,吸取50 μL/孔细胞上清液于96孔板中,然后分别加入等体积的Griess A和B,室温孵育10 min,540 nm处测定吸光度,根据NaNO2的连续稀释标准曲线计算每个样品中的NO浓度。

2.4 ELISA法测定TNF-α浓度

细胞按照1×106个/mL每孔100 μL接种于96孔板,5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养细胞贴壁后,按“2.1.1”方法分组处理细胞,孵育12 h后收集细胞上清液,按照ELISA试剂盒测定细胞上清液TNF-α浓度,根据标准曲线计算每个样品中TNF-α浓度。

2.5 细胞内ROS以及线粒体源ROS的检测

细胞按照1×105个/孔接种于12孔板,37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜,按“2.1.2”方法分组处理细胞,处理结束后,吸弃培养基,PBS清洗一遍。对于细胞内ROS的测定,加入10 μmol/L DCFH-DA荧光探针,37 ℃黑暗条件孵育30 min,吸弃探针,预热的PBS清洗两遍,500 μL PBS重悬细胞,放入冰盒避光,利用流式细胞仪在470/530 nm下测定胞内ROS水平。对于线粒体源ROS的测定,5 μmol/L Mito-SOX荧光探针代替DCFH-DA荧光探针,流式细胞仪在510/580 nm下测定线粒体源ROS水平。

2.6 细胞线粒体膜电势(MPP)的测定

细胞按照1×105个/孔接种于12孔板,37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜,按“2.1.2”方法分组处理细胞,孵育24 h。处理结束后,吸弃培养基,PBS清洗一遍,加入10 μmol/L JC-1荧光探针,37 ℃在黑暗环境下培养30 min,然后预温的PBS洗涤两次,并悬于PBS中,使用流式细胞仪进行分析线粒体膜电势。

2.7 细胞线粒体质量数以及ATP的测定

细胞按照1×105个/孔接种于12孔板,在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜,按“2.1.1”方法分组处理细胞,孵育24 h,处理结束后,加入150 nmol/L Mito-Tracker Green荧光探针在37 ℃黑暗条件下孵育30 min,然后用预热的PBS洗涤细胞两次,将细胞悬浮于PBS中,并在490/516 nm下使用流式细胞仪进行测定分析线粒体质量数。对于ATP的测定,使用基于荧光素酶的荧光增强ATP检测试剂盒测定RAW 264.7巨噬细胞中ATP含量,用冰冷的PBS清洗细胞,加入100 μL冰冷的ATP裂解液,裂解完全后,12 000×g,4 ℃离心5 min,上清用于多功能酶标仪进行ATP含量的测定。

2.8 细胞内蛋白表达检测

细胞按照3×105个/孔接种于6孔板,在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜,按“2.1.1”方法分组处理细胞,孵育24 h。处理结束后,用预冷的PBS洗涤两遍,并用含有蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液裂解(RAPA/PMSF=100/1,PMSF母液浓度为100 μmol/L)充分裂解后,12 000×g,4 ℃离心15 min。然后用BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质提取物并电转移到PVDF膜上。用含有5%无脂牛奶的TBS-T缓冲液封闭PVDF膜90 min,并在4 ℃下与一抗孵育摇床过夜。用TBST洗涤3次后,将膜与二抗在室温下温育1 h,TBST洗涤3次,然后用增强的化学发光(ECL)试剂拍摄图像,蛋白条带利用Image J处理进行定量分析。

2.9 细胞转录因子mRNA水平的测定

细胞按照3×105个/孔接种于6孔板,在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜,按“2.1.1”方法分组处理细胞,孵育12 h。处理结束后,Trizol法提取细胞总RNA:离心机预冷准备;准备好相关无RNA酶试剂和实验耗材;超净台面用酒精和DEPC水擦拭。去除细胞培养基,PBS清洗两遍,加入500 μL Trizol,吹打至EP管中,上下混匀,室温放置5 min。加入100 μL氯仿,混匀,室温放置5 min,12000×g,4 ℃离心15 min,分三层,RNA在上层清液中。转移到新的EP管中。加入与上清等体积的异丙醇,轻轻混匀,室温静置10 min。12 000×g,4 ℃离心10 min倾倒异丙醇。75%乙醇洗涤沉淀。离心去除上清,超净台中中风速吹风晾干。DEPC水溶解总RNA,放在冰盒上待用,长时间保存需要转移到-80°C冰箱中。

(1)cDNA的合成:RNA、oligodT、DEPC水比例混匀,PCR仪上72 ℃、3 min循环一次。在上述基础上,按比例加入Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶、DEPC水42 ℃、90 min循环一次;70 ℃、15 min循环一次。即得cDNA。

(2)实时荧光定量PCR:目的基因的引物序列如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab.1 Sequence of primers for quantitative real-time PCR

配制实时荧光定量PCR扩增反应体系:10 μL SYBR®Premix Ex Taq TM Ⅱ+1 μL primers+1μL cDNA模板+0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ+6.6 μL DEPC水。将上述反应液放入荧光定量PCR仪中进行扩增,PCR反应条件如表2所示。

表2 实时荧光定量PCR反应程序Tab.2 Reaction program for quantitative real-time PCR

(3)相对定量分析:目的基因的表达采用比较Ct值,用内参基因β-actin来校正差异,变化的倍数量为2-ΔΔCt。计算公式为:变化倍数=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)药物处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

2.10 统计学方法

3 结 果

3.1 ISL对RAW 264.7细胞存活的影响

为探究ISL对小鼠巨噬细胞RAW 264.7存活的影响,不同浓度的ISL处理24 h后(图2),ISL浓度依赖性的抑制细胞增殖(P<0.05)。结果显示,在ISL低于20 μmol/L的浓度处理下,细胞存活率没有显著性变化,因此,ISL在低于20 μmol/L浓度时对RAW 264.7细胞的增殖没有明显的抑制作用,故选用5～20 μmol/L浓度范围进行后续实验。

与对照组相比, *P < 0.05, **P<0.01。图2 ISL对RAW 264.7细胞增殖的影响Fig.2 Effect of ISL on the proliferation of RAW 264.7 cells

3.2 ISL对LPS诱导RAW 264.7细胞NO和TNF-α释放的影响

如图3结果显示,ISL在5、10和20 μmol/L浓度范围内对可以显著抑制由LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO和TNF-α的过量产生并呈剂量依赖关系,同时,20 μmol/L ISL对NO和TNF-α的过量产生有较好的抑制作用,可以使它们大致恢复至空白对照组水平。

与对照组相比,**P < 0.01;与模型组相比,##P < 0.01。图3 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞释放NO和TNF-α的抑制作用Fig.3 Isoliquiritigenin inhibited the release of NO and TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.3 ISL对LPS诱导RAW 264.7细胞iNOS蛋白表达的影响

如图4结果显示,对照组RAW 264.7细胞中iNOS蛋白表达量较少,经LPS刺激24 h后,其表达量显著增加,而20 μmol/L ISL对iNOS的过量表达具有显著抑制作用,可以使iNOS蛋白水平大致恢复至空白对照组水平,从而发挥抗炎活性。

与对照组相比,**P < 0.01;与模型组相比,##P < 0.01。图4 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞iNOS蛋白表达的影响Fig.4 Effect of ISL on the protein expression of iNOS in LPSinduced RAW 264.7 cells

3.4 ISL对LPS诱导RAW 264.7细胞胞内ROS以及线粒体源ROS水平的影响

如图5(a),(b)结果所示,与对照组相比,模型组胞内DCF荧光强度(P< 0.01)显著提高,表明LPS能上调RAW 264.7细胞内ROS生成。阳性对照组(10 mmol/L NAC)能够显著降低由LPS引起胞内ROS的增加,并且ISL预处理组可以显著降低LPS引起的ROS增加。图5(c),(d)结果显示,与对照组相比,模型组中Mito-SOX荧光强度(P<0.01)显著升高,表明LPS可以上调RAW 264.7细胞中线粒体源ROS的生成。阳性对照组(10 μmol/L Mito-tempo)能够显著降低LPS引起的线粒体源ROS的增加,而20 μmol/L ISL预处理组可以显著降低由LPS引起的线粒体源ROS的增加。

与对照组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05;##P<0.01。图5 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞胞内以及线粒体源ROS 的影响Fig.5 Effect of ISL on intracellular or mitochondrial ROS levels in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.5 ISL对LPS诱导RAW 264.7细胞线粒体膜电势以及ATP产生的影响

图6(a,b)结果显示,细胞经LPS处理后,RAW264.7细胞线粒体膜电势与对照组相比显著降低。而ISL预处理后,RAW 264.7细胞线粒体膜电势有所改善。其中10和20 μmol/L的ISL预处理后,与模型组相比,细胞线粒体膜电势具有显著性差异。图6(c)结果显示,经LPS处理后,RAW 264.7细胞中线粒体产生ATP的能力与对照组相比显著降低。ISL预处理后,ATP的产生有所增加,线粒体功能可恢复至空白组水平,用5和10 μmol/L ISL预处理后,与模型组相比,ATP的产生无显著性差异。然而,用20 μmol/L的ISL预处理后,与模型组相比,ATP的含量显著增加,线粒体功能恢复至与对照组相似水平。

3.6 ISL对LPS诱导RAW 264.7细胞线粒体质量数的影响

图7(a,b)结果显示,与对照组相比,模型组中Mito-Tracker荧光强度(P< 0.01)显著升高,表明LPS可以上调RAW 264.7细胞中线粒体质量数水平,此结果与前面LPS上调RAW 264.7细胞中ROS水平相对应,而ISL预处理组可以显著降低由LPS引起的线粒体质量数的增加。

与对照组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05;##P<0.01。图6 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞线粒体功能的影响Fig.6 Effect of ISL on mitochondrial function in LPS-induced RAW 264.7 cells

与对照组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05;##P<0.01。图7 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞线粒体质量数的影响Fig.7 Effect of ISL on mitochondrial mass in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.7 ISL处理对LPS诱导RAW 264.7细胞线粒体生物发生相关蛋白表达的影响

图8结果显示,细胞经LPS处理后,RAW264.7细胞中PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表达水平与对照组相比显著降低,经不同浓度的ISL预处理后,PGC-1α和Tfam的表达水平与模型组相比显著升高,而NRF1表达水平有所升高但没有显著性差异。因此,ISL可以通过改善线粒体生物发生来维持细胞正常生理功能。

与对照组相比,*P<0.05;**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05。图8 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞线粒体生物发生相关蛋白表达的影响Fig.8 Effect of ISL on expression of mitochondrial biogenesisrelated proteins in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.8 ISL对LPS诱导RAW 264.7细胞线粒体生物发生相关mRNA表达水平的影响

本实验采用实时荧光定量PCR方法探究ISL对RAW 264.7细胞中线粒体生物发生相关基因如PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的影响。实验结果如图9所示,模型组中PGC-1α、NRF1和Tfam的表达水平都较低, 与对照组相比其差异具有统计学意义,由此可以说明细胞在炎症状态下线粒体生物发生过程损伤,不能行使正常的生理功能,从而表现出线粒体功能紊乱。ISL预处理后PGC-1α、NRF1和Tfam基因表达水平均有所提高,并与模型组相比差异较明显。因此,ISL可以通过改善线粒体生物发生相关mRNA表达水平来维持细胞正常生理功能。

与对照组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05;##P<0.01。图9 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞线粒体生物发生相 关mRNA表达水平的影响Fig.9 Effect of ISL on mitochondrial biogenesis-related mRNA expression in LPS-induced RAW 264.7 cells

3.9 ISL处理对LPS诱导RAW 264.7细胞线粒体动力学的影响

图10结果显示,细胞经LPS处理后,RAW 264.7细胞中Drp1表达水平与对照组相比显著升高,而Mfn1、2表达水平与对照组相比显著下降。经不同浓度的ISL预处理后,RAW 264.7细胞中Drp1表达水平与模型组相比有所下降,但没有统计学意义,而Mfn1、2表达水平与模型组相比显著下降,且呈良好的剂量依赖关系。因此,ISL可以通过改善线粒体融合分裂状态来维持其平衡,对维持细胞正常形态和功能至关重要。

与对照组相比,*P<0.05;**P<0.01;与模型组相比,##P<0.01。图10 ISL对LPS 诱导RAW 264.7细胞线粒体动力学的影响Fig.10 Effect of ISL on mitochondrial dynamics in LPS-in-duced RAW 264.7 cells

4 讨 论

研究发现大量代谢性疾病的临床病例都存在线粒体功能障碍,为了研究线粒体功能障碍与炎症之间的关系,本研究使用ISL预处理RAW 264.7巨噬细胞1 h,然后LPS刺激一定时间,检测线粒体功能相关指标。由图3、4可知,LPS刺激成功地在RAW 264.7巨噬细胞中建立了炎症模型,并且验证了ISL的抗炎活性。ISL的抗炎机制主要在于抑制NF-κB P65和AP-1的活化以及抑制ERK/MAPK通路中ERK的磷酸化水平,通过RAW264.7细胞中的ERK1/2途径诱导HO-1的表达,发挥下调iNOS及COX-2的基因和蛋白表达的作用[12],抑制LPS诱导NO、L-1β和TNF-α的产生,而且HO-1可以通过LPS诱导的NO和TNF-α的产生反向介导ISL的抗炎反应[13]。

LPS刺激巨噬细胞产生NO、TNF-α、IL-6以及IL-1β等炎症因子主要通过髓样分化因子88(MyD88)依赖型和MyD88非依赖型[14]。其中NO的产生就是由iNOS和NADPH催化L-精氨酸为瓜氨酸来完成的[15]。对于结果图3中低浓度ISL(5 μmol/L)即对LPS诱导的细胞内NO水平有非常显著的抑制作用,但图4中只有高浓度ISL(20 μmol/L)对iNOS的水平才有明显抑制作用,另外两个低浓度都未见变化,可能是ISL处理损伤了NADPH氧化酶的功能,尽管有大量iNOS的产生,但是由于NO产生过程中也需要NADPH的参与,所以中低浓度ISL处理组中NO水平较低。

图5、6结果显示,在炎症发生过程中,细胞中ATP和线粒体膜电势水平显著降低,而胞内总ROS和线粒体源ROS水平显著升高,经ISL预处理可以使它们大致恢复至对照组水平。细胞中的ROS可能影响线粒体质量数水平,本研究采用流式细胞术考察了ISL处理对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞线粒体质量数的影响。图7结果表明线粒体质量数在ISL处理后显著降低,细胞中ROS的下降可能与线粒体质量的降低有关,这可能是细胞维持能量供应的一种补偿机制。

线粒体生物发生受到PGC-1α、NRF1和TFam等多种因素的调控。NRF1可以促进核编码的线粒体蛋白的转录,包括参与氧化磷酸化和呼吸复合物的蛋白。Tfam可通过直接与线粒体基因组结合,增强线粒体DNA的复制和转录,PGC-1α作为一种关键的转录共激活因子,调控NRF1和TFam等关键因子,并促进线粒体生物发生[16]。当这些转录因子的表达发生变化时,线粒体生物发生可能会发生紊乱。图8和9结果表明,LPS处理显著降低了巨噬细胞中PGC-1α、NRF1和TFam的蛋白和mRNA表达水平,而经ISL预处理后,它们的蛋白和mRNA表达水平又可大致恢复至对照组水平。

线粒体功能障碍和形态学的改变与多种疾病密切相关[17],因此,线粒体形态的调控是细胞能量供应充足的关键,需要对线粒体形态调控蛋白进行定量和定性控制,以达到线粒体分裂与融合的动态平衡[18-19]。本研究证实了LPS处理后线粒体形态的关键调控因子的变化,如图10所示,巨噬细胞经LPS刺激后,Drp1和Mfn1、2的蛋白表达发生了相反的变化,表明线粒体融合分裂平衡受到破坏,经过ISL预处理后,分裂蛋白Drp1表达水平有所下降,而Mfn1、2表达水平与模型组相比显著升高,且呈良好的剂量依赖关系。因此,ISL可能通过抑制LPS刺激巨噬细胞炎症反应有效改善线粒体的生物发生。然而,对于线粒体形态和功能变化的确切分子机制了解甚少,也缺乏对能量代谢和炎症反应的重要调控位点及其如何随疾病变化的研究。基于本研究,我们希望通过探索线粒体在各种疾病中发生的定量和定性变化,以及研究确切的分子作用机制和控制方法,开发新的治疗策略。

5 结 论

本研究以RAW 264.7巨噬细胞为体外模型来评价ISL的抗炎作用与线粒体功能之间的联系,证实了ISL可以有效改善炎症反应下的线粒体功能障碍,使细胞恢复正常功能。