时间分辨荧光免疫法定量检测给药食蟹猴血清中纳武利尤单抗

刘 欢,沙春洁,邵 馨,刘万卉,

(1. 烟台大学药学院，分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学)，新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心，山东 烟台，264005；2.山东绿叶制药有限公司长效和靶向制剂国家重点实验室，山东 烟台 264003)

纳武利尤单抗(百时美施贵宝,Nivolumab)是一种全人源化IgG4单克隆抗体,它可以选择性地与PD-1结合并阻止PD-1和PD-L1或PD-L2之间在肿瘤上的相互作用,从而防止T细胞衰竭;还可以使已经衰竭的T细胞重新激活,发挥免疫作用,杀死肿瘤细胞,从而减缓或阻止肿瘤生长,以达到治疗目的[1]。该药于2015年在美国获批用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC),现已获批用于15个适应症、8个瘤种的治疗。 为评估药物在受试者体内的药代动力学特征,需定量检测各时间点采集的血清样本中的药物浓度。目前抗体药物定量检测的首选方法是配体结合法(Ligand binding assay, LBA)[2],此类方法中的酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)因成本低、操作简单、通量高而最为常用。ELISA是酶催化底物显色,通过测定特定波长下显色底物吸光度来进行定量的方法,而酶催化底物从开始显色到显色饱和的浓度范围较窄,所以此方法检测范围较窄，对于高浓度的血浆样品往往需要多步稀释,操作繁琐。因此，为了减少样品处理时间,有必要建立一种检测范围比ELISA更宽的方法。

时间分辨荧光免疫检测技术(Time-resolved fluorescence immunoassay, TRFIA)是基于镧系螯合物(Eu, Sm, Tb, Dy)发出的荧光来检测待测物的免疫分析法,镧系元素的荧光寿命远高于血清样本中存在的荧光物质,可在本底荧光衰变后检测镧系元素的荧光信号,从而降低荧光物质的干扰[3]。信号响应随荧光标记物浓度增大而增大的范围宽,因此检测范围也更宽。目前TRFIA较多地应用于细胞因子、生物标志物、蛋白、多肽等的检测[4-7]。基于配体结合原理,标记有镧系元素的二抗与药物结合也能实现对抗体药物的定量检测。本实验建立了基于TRFIA法检测食蟹猴血清中抗体药纳武利尤的方法,对其进行了方法学验证,结果符合中国药典对生物样品检测的要求。对食蟹猴静脉给药纳武利尤单抗的血清样本进行检测,并与经过验证的ELISA方法进行了比较。

1 材 料

1.1 动物

体重3.0～5.0 kg的雄性食蟹猴3只[来自广州相观生物科技有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2018-0043,实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2016-0090]。空白食蟹猴个体血清(北京汇智泰康医药技术有限公司)。

本试验涉及的动物福利均遵循湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司动物福利指导原则(指导原则编号:GAW 018-2018)。研究提交实验动物使用和管理委员会(IACUC)审核和批准。试验期间动物管理和使用遵循美国National Academy Press出版的《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》(2011)、国家科学技术委员会2017年修订的《实验动物管理条例》。本试验所涉及的动物管理、使用和相关操作均经过湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准,批准文号:IACUC(准)-2019-076。

1.2 试剂耗材

供试药物:纳武利尤单抗(Opdivo,批号:ABA8488,百时美施贵宝公司); 生物素标记药物: Biotin-opdivo (山东博安生物技术有限公司进行生物素标记);Eu标记的山羊抗人 IgG 抗体、解离增强液、低荧光96孔板均来自于PerkinElmer;PD-1蛋白(R&D systerm);高吸附96孔板(Thermo);TMB(sigma);HRP标记的山羊抗人IgG抗体(SouternBiotech)。

1.3 仪器

酶标仪(型号:SpectraMaxM5e,来源:Molecular Devices),微孔板恒温振荡器(型号:PHMP-4,来源:Grant bio),洗板机(型号:405LS,来源:BioTeK)。

2 方 法

2.1 TRFIA方法的建立

参照已有的ELISA方法,选择间接TRFIA法作为检测方式。实验步骤为:PD-1蛋白100 μL/孔包板,4 ℃静置过夜,次日用1% BSA封闭,37 ℃振荡孵育1 h,洗板后上样,样品100 μL/孔,37 ℃振荡孵育1 h,加入Eu标记的山羊抗人IgG抗体,100μL/孔,孵育1 h;洗板后加解离增强液,200 μL/孔,室温振荡15 min,读取时间分辨荧光,采用四参数回归方程拟合标准曲线,计算样品浓度。对读板条件、PD-1蛋白包板质量浓度、Eu标记的山羊抗人 IgG 抗体质量浓度进行摸索。

2.2 ELISA方法

微孔板包被PD-1蛋白,4 ℃静置过夜,次日用1% BSA封闭,37 ℃振荡孵育1 h,洗板后上样,37 ℃振荡孵育1 h,加入HRP标记的山羊抗人IgG抗体,孵育1 h;洗板后加TMB,100 μL/孔,室温避光反应25 min,1 mol/L磷酸终止,读板。

2.3 TRFIA方法学验证

根据2020版中国药典生物样品定量分析指导原则项下配体结合分析[8]进行方法学验证。

2.4 动物实验

食蟹猴静脉推注单次给药,剂量为3 mg/kg,给药体积0.3 mL/kg,在给药肢体的对侧前肢或后肢皮下静脉取血,血样采集时间点:给药前(0 h),给药开始后0.25 h(15 min)、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h(D 2)、72 h(D 4)、168 h(D 8)、240 h(D 11)、336 h(D 15)、504 h(D 22)。收集全血至采集管中,待血液凝结后2～8 ℃离心,3500 r/min,离心10 min,分离血清,放置于-80 ℃超低温冰箱冻存待测。

2.5 样品检测

分别用TRFIA和ELISA方法对食蟹猴血清样品进行检测,并比较两组数据的差异。

2.6 统计学方法

采用 WinNolin(8.1)软件的非房室模型法(NCA)对药代动力学参数进行计算。利用 Micro-soft Excel(2010)计算均值、标准差和变异系数。

3 结 果

3.1 方法优化结果

3.1.1 荧光条件选择 Eu3+螯合物通常在615 nm处有最大发射光[9],读取激发光为250～450 nm,发射光为615 nm的荧光,得到图1所示的激发光谱,由图1可知 Eu3+螯合物在激发波长为340 nm,发射波长为615 nm条件下有最强的荧光信号,因此选择此条件进行检测。

图1 Eu3+螯合物激发光谱Fig.1 Eu3+ chelate excitation Spectrum

3.1.2 时间分辨条件选择 考察在不同时间分辨条件下对本底荧光的消除情况,结果如表1所示,没有经过时间延迟,猴血清和空白板有很强的荧光信号,200 μs过后,本底荧光很小,对检测几乎没有影响。但Eu3+螯合物仍有很强的荧光信号。

表1 时间分辨设置Tab.1 TRF setting

3.1.3 捕获抗原质量浓度的选择 PD-1蛋白用PBS配制成0.5、1、2、4、10 μg·mL-1,100 μL/孔包板,4 ℃静置过夜,次日封闭后加入高浓度的纳武利尤单抗,37 ℃振荡孵育1 h,加入Eu标记的山羊抗人IgG抗体,100 μL/孔,孵育1 h;洗板后加解离增强液,200 μL/孔,室温振荡15 min,在激发光340 nm,发射光615 nm波长下读取经200 μs延迟至1 000 μs的荧光。由包板质量浓度-荧光积分值曲线(图2)可知，当包板质量浓度大于2 μg·mL-1时,荧光计数趋于饱和,因此2 μg·mL-1的PD-1为最佳包板质量浓度。

图2 不同PD-1包板质量浓度下的结合曲线Fig.2 Binding curves at different PD-1 coating concentrations.

3.1.4 不同Eu3+-山羊抗人IgG抗体质量浓度的选择 考察PD-1包板质量浓度为2 μg·mL-1,纳武利尤单抗 100 ng·mL-1条件下不同质量浓度标记二抗特异性/非特异性响应信号值,结果如图3所示,检测抗体质量浓度为100 ng·mL-1时,特异性/非特异性信号比最高,因此选择100 ng·mL-1的铕标记山羊抗人IgG抗体进行检测。

图3 不同Eu3+-山羊抗人IgG质量浓度的特异性和非特异性结合曲线Fig.3 Specific and non-specific binding curves at different Eu3+-goat anti-human IgG concentrations

3.1.5 优化后的实验流程 2 μg·mL-1PD-1蛋白100 μL/孔包板,4 ℃静置过夜,次日用1% BSA封闭,37 ℃振荡孵育1 h,洗板后上样,标曲质控用空白食蟹猴血清配制,与待测样品在上样前用0.1% BSA/PBST溶液稀释,100 μL/孔上样,37 ℃振荡孵育1 h,加入100 ng·mL-1Eu标记的山羊抗人IgG抗体,100 μL/孔,孵育1 h;洗板后加解离增强液,200 μL/孔,室温振荡15 min,读取激发波长为340 nm,发射波长为615 nm,200～1 000 μs时间分辨荧光积分值。

3.2 方法学验证结果

3.2.1 标准曲线范围 对标准系列质量浓度样品(2 500、625、156.25、39.06、9.77、2 ng·mL-1)进行检测,所得的荧光强度积分值与质量浓度值GraphPad软件经过四参数拟合,得到标准曲线回归方程为y=(A-D)/(1+x/C)B,A=2 244,B=0.922,C=113.9,D=2.74,R2=1.000 0,标准曲线见图4。方法的定量范围为2～2 500 ng·mL-1,灵敏度为2 ng·mL-1。

图4 纳武单抗的四参数校正曲线Fig.4 Calibration curve of nivolumab detection

3.2.2 精密度和准确度 连续3天共评价了6批质控样品,每批包含1套标准曲线(2 500、625、156.25、39.06、9.77、2 ng·mL-1),5套质控样品(2 500、2 000、300、5、2 ng·mL-1)。各质量浓度标曲、质控样品用空白食蟹猴血清配制,上样前用0.1% BSA/PBST稀释液稀释50倍。批内批间准确度均值应在质控样品标示值的±20%范围内,对于定量下限和定量上限,应在标示值的±25%范围内。批内批间变异系数一般不得超过20%,定量上下限的变异系数不得超过25%。精密度准确度结果见表2。定量上限、定量下限的批内精密度在 3.6%～14.2%范围内,批间精密度在10.0%～10.6%范围内。低、中、高质量浓度质控的批内精密度在 1.2%～16.5%内,批间精密度在 9.6%～12.2%范围内。定量上下限的准确度在-14.3%～11.9%。低中高质量浓度质控准确度在-14.3%～11.4%范围内。符合中国药典要求。

表2 方法精密度与准确度(n=6)Tab.2 Precision and accuracy of method(n=6)

3.2.3 稳定性 考察高、低两个质量浓度水平的质控样品(2 000、5 ng·mL-1)在实验台上稳定性(样品预处理后室温放置4 h,室温放置12 h)、长期稳定性(-80 ℃冻存1个月)以及反复冻融稳定性(3个周期),每个考察条件的高、低质量浓度样品各三份。实验结果见表3,结果表明,各个考察条件的质控样品回算质量浓度的回收率在理论质量浓度的92.1%～101.5%范围内,精密度在7.0～18.8%内,满足中国药典接受标准。

表3 纳武利尤单抗在食蟹猴血清中的稳定性Tab.3 Stability of nivolumab in cynomolus monkey serum

3.2.4 选择性 选择10个空白个体血清进行选择性考察。10个个体的空白样品均不能检测到纳武利尤单抗,LLOQ回收率在理论质量浓度的80.2%～118.9%范围内,说明基质中存在的非相关物质对检测没有干扰。

3.2.5 稀释线性和钩状效应 对150 000、30 000、3 000、600 ng·mL-1的纳武利尤单抗食蟹猴血清样本用空白食蟹猴血清稀释后进行检测,回收率在82.5%～111.9%,精密度在2.8%～15.1%,表明不同的稀释倍数不影响检测的准确性。对上述样品不经空白食蟹猴血清稀释检测,荧光读数随浓度增加而增加,说明在600～10 000 ng·mL-1范围内无钩状效应。

3.2.6 样品检测结果 通过TRFIA和ELISA两种方法检测对来自3只食蟹猴的33个血清样本获得的药时曲线图见图5;用 WinNolin(8.1)软件的非房室模型法(NCA)对药代动力学参数进行计算，结果见表4。TRFIA和ELISA两种方法测得的药时曲线趋势相似,两种方法所测数据用 Micro-soft Excel(2010)进行单因素方差分析,P>0.05,说明两种方法所测数据间无显著性差异。对TRFIA与ELISA检测来自3只动物的33个血清样本结果进行线性拟合,拟合的曲线见图6,得到的线性回归方程为y=0.986 85x+1.286 42(R2=0.941 73),表明两种方法相关性良好。

图5 TRFIA、ELISA两种方法测得纳武利尤单抗在食蟹猴体内的药时曲线Fig.5 plasma concentration-time profiles of nivolumab in cynomolgus monkey determined by TRFIA and ELISA

表4 TRFIA和ELISA检测食蟹猴血清中纳武利尤单抗的药代动力学参数Tab.4 Pharmacokinetic parameters of plasma from cynomolgus monkeys based on drug-concentration of nivolumab,as determined by TRFIA and ELISA

图6 TRFIA、ELISA两种方法测得测得纳武利尤单抗质量之间的线性关系Fig.6 Linear correlation between the nivolumab concentration determined by TRFIA and ELISA

4 讨论与结论

本实验首次建立了TRFIA法检测纳武利尤单抗在食蟹猴血清中浓度的方法,对间接TRFIA法的荧光条件、时间分辨条件、捕获抗原质量浓度、检测二抗质量浓度进行了比较,确定了最佳读板条件为激发波长340 nm,发射波长615 nm,在时间分辨模式下读取200～1000 μs荧光,最佳包板质量浓度为2 μg/mL,最佳Eu标记山羊抗人IgG抗体质量浓度为100 ng·mL-1。对该方法进行了方法学验证,结果符合中国药典对生物分析方法的要求。PLUIM D等[10]开发的ELISA法检测人血清和脑脊液中纳武利尤单抗,检测范围为2～100 ng·mL-1。本实验建立的TRFIA方法与ELISA法相比,灵敏度相当,但检测范围更宽,检测范围为2～2 500 ng·mL-1,是ELISA法的25倍。对于食蟹猴血浆样品,两种方法检测结果间的差异无统计学意义。与其他配体结合法相比,TRFIA没有放射性免疫法的放射性污染的缺点[11];试剂耗材价格远低于电化学发光法(ECL);线性范围比ELISA宽,因此TRFIA有望在抗体药物的药代动力学研究中有更广的应用。