免疫状态监测在器官移植患者中的应用

李 伟 程 丰 综述 王锁刚 审校

随着器官移植技术精益求精和围手术期的管理精细化,对适应性和固有免疫应答的深入了解,移植物和器官移植受者短期存活率得到显著提高。然而,如何减少免疫抑制的药物不良反应,降低器官移植慢性排斥反应及感染的发生率仍然面临着巨大挑战。目前,器官移植受者的免疫抑制治疗通常是按照传统方案进行,根据移植物的功能或组织学评估和(或)药物毒性或感染的迹象进行调整,这样使患者暴露于较高的感染率和药物毒性,或因排斥反应而增加急性和慢性移植物损伤的风险。因此,需要开发可靠的生物标志物用于免疫监测,评价患者免疫风险。

免疫系统是由免疫细胞,细胞因子,趋化因子,抗体和补体系统组成的复杂网络。因此,免疫监测所基于的生物标记必须在分析上具有可靠性、敏感度、特异度及可适用性强的特点[1]。单纯药物浓度的监测,不能反映受者机体的免疫状态,结合免疫状态的指标更有利于药物浓度的调整。淋巴细胞亚群/百分比只能反映其数量而非功能。本文拟简述在器官移植中常用的免疫监测指标。

T淋巴细胞亚群计数及功能

活化T细胞表面抗原T细胞的活化涉及特定受体蛋白、黏附分子、趋化因子受体、共刺激分子和主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)类分子的表达。可溶性抗原sCD30与移植排斥反应和长期移植功能相关[2]。CD28调节T细胞增殖和分化,并在体内免疫反应途径中发挥重要作用,CD95与早期排斥反应相关[3],CD28和CD95在这方面是似乎很有前途,但CD28可能并不反映T细胞活化,CD95与感染也有关系。

滤泡辅助T细胞和调节T细胞滤泡辅助T细胞(Tfh)与移植中的供者特异性抗体(DSA)形成有关[4], 滤泡调节T细胞(Tfr)能防止DSA形成,降低抗体介导的排斥反应(ABMR)发生率[5]。有研究表明[6],在小鼠皮肤移植模型中,Tfh对移植中DSA生成具有良好的预测作用。因此,监测 Tfh/Tfr比值有望为ABMR风险的患者提供个性化的免疫抑制药物治疗,但目前经验有限,需要进一步理论研究。

T淋巴细胞免疫功能和记忆性细胞毒性T细胞功能20世纪美国食品和药物管理局(FDA)批准T淋巴细胞免疫功能检测试验(Cylex ImmuKnow)用于测量有丝分裂原刺激的CD4淋巴细胞产生的ATP,测得的ATP值即代表细胞免疫的活性,《Cylex指南》将弱免疫应答分类为ATP水平<225 ng/ml,提示免疫抑制过度;ATP水平226～524 ng/ml,中度免疫抑制;ATP水平>525 ng/ml,免疫高危[7]。研究发现,当ATP水平<130 ng/ml或者ATP水平>450 ng/ml时,免疫应答处于高排斥反应状态,这一结果提示可能的最佳目标治疗范围[8]。在移植前评估中,该检测作为一种一次性检测可能有助于确定诱导治疗的必要性,以及制订肾移植后免疫治疗和排斥反应监测的个性化方案。

记忆性细胞毒性T细胞功能测定是一种细胞功能测定法,测定受者淋巴细胞在细胞培养中对供者淋巴细胞的免疫反应。将供者/受者外周血单核细胞(PBMC)混合培养16h,用流式细胞仪检测表达炎症标志物CD154的T细胞[9]。Rohan等[10]发现,供者CD154+记忆性细胞毒性T细胞反应与急性细胞性排斥反应的组织严重性呈正相关。该方法评估肾移植后急性细胞排斥反应的可能性,确定移植器官是否引起移植受者的免疫反应增强。

细胞因子研究表明除了Th1和Th2细胞的分化和细胞因子的产生外,幼稚的人CD4 T细胞通过白细胞介素6(IL-6)和转化生长因子β(TGF-β)的作用,也能分化为Th17细胞[11]。Th17细胞可能通过分泌IL-17和IL-22在排斥反应和慢性移植物损伤中发挥作用。此外,在同种异体排斥反应和免疫耐受中,Th17和Treg细胞之间的平衡似乎是至关重要[12]。IL-17的检测仅仅被认为是器官移植中急性排斥反应风险的预测性生物标志物,需要进一步的研究。

钙调神经磷酸酶抑制的功能效应,可通过实时聚合酶链反应定量分析全血样本中干扰素γ(IFN-γ)和IL-2的基因表达来监测[13],酶联免疫斑点技术(ELISPOT)实验方法在肾移植术前使用,与急性排斥反应、慢性排斥反应以及移植物功能之间有明确的相关性[14],同时也有研究发现,器官移植术后使用ELISPOT实验方法有助于监测感染[15],通过ELISPOT、细胞内流式细胞术或残余活化T细胞核因子(NFAT)基因表达监测IFN-γ的产生,可能有助于评估患者的排斥反应风险和个人反应,并预测移植结果,这有助于肾脏和肝移植受者制订免疫抑制治疗。需要进一步的临床试验来证明基于细胞因子的免疫检测用于预测排斥反应、感染和移植物损伤的作用。

B淋巴细胞

DSADSA是B细胞在免疫应答中的标志物。DSA升高与同种异体移植物长期预后不良有关,DSA结合补体可能会提高预测能力[16]。DSA的数量和分型是其结合补体的两个决定因素。不同亚型、不同补体结合意义不同,其中IgG1是最主要的亚型并能反映IgG的总体水平,无ABMR的患者大多数单独存在IgG1或未检测到亚类,IgG3有更强的C1q结合能力,并激活补体级联。尽管IgG2激活补体能力很弱,IgG4根本不能激活补体,但是两者均可通过Fc受体募集效应细胞,IgG4与排斥反应的晚期阶段有关。无论是术前还是术后出现C1q和C3d DSA都明显增加肾移植受者急性排斥反应、移植物丢失等不良临床预后的风险[17-18]。随着补体结合DSA分析和IgG亚类分析的进步,提高了评估患者免疫学风险的能力。

CD19+CD24hiCD38hi过渡性B细胞B淋巴细胞在免疫排斥中的标志物CD19+CD24hiCD38hi过渡性B细胞已经引起许多学者的兴趣。一项前瞻性研究[19],纳入73例初次肾移植受者,收集受者移植前/后B细胞分型以及移植后48±6个月临床免疫学及生物化学相关数据,此类过渡性特殊类型B淋巴细胞与急性排斥反应之前存在负相关。该研究支持过渡特殊类型B细胞作为生物标志物和移植治疗干预的潜在相关性。但仍需要进一步研究该标志物在预测急性排斥反应中的灵敏度和特异度。

CD20+CD24hiCD38hi过渡性B细胞和CD20+CD28loCD24lo幼稚B细胞B淋巴细胞在免疫耐受中的标志物CD20+CD24hiCD38hi过渡性B细胞和CD20+CD28loCD24lo幼稚B细胞可能有助于评估患者免疫状态,Chesneau等[20]研究证实,通过对比自愿受试者(18例)、撤除免疫抑制剂的免疫耐受肾移植受者(9例)和免疫抑制剂支持的稳定肾移植受者(15例)的移植后第0天、第2天、第4天、第6天的B淋巴细胞亚型,可以发现CD20+CD24hiCD38hi过渡性B细胞和CD20+CD28loCD24lo幼稚B细胞在免疫耐受受者有更高的表达频率,并且大量分泌IL-10,同时减少体液中浆细胞分化因子的释放。然而,这种类型细胞对长期移植功能状态的预测有待研究。

自然杀伤细胞(NK细胞)

NK细胞在免疫耐受的形成过程中起着重要的作用,同时可介导器官移植排斥反应,造成移植物损伤。它与急性排斥反应存在正相关性[21],但在急性移植物抗宿主病中的机制和免疫调节作用仍不清楚,值得深入研究。

尿液生物标志物

尿液生物标志物的发展2001年Li等[22]纳入急性排斥反应(22例)和无急性排斥反应(63例)肾移植受者的尿液样本发现,穿孔素mRNA和颗粒酶B的mRNA水平在急性排斥反应患者的尿液标本中表达更高。2005年Muthukumar等[23]纳入83例肾移植受者的尿液样本发现,尿液中的叉头状螺旋因子3(FOXP3)mRNA水平,除了诊断急性细胞介导排斥反应(ACR)外还可预测对抗排斥治疗的反应和ACR发作后移植肾的结局。2013年Suthanthiran等[24]纳入485例肾移植受者,从移植后第3天到第12个月的尿液样本,分别监测移植受者尿液中穿孔素、颗粒酶B、CD3、CD103,干扰素诱导蛋白10(IP-10)和FOXP中的表达水平,发现与急性细胞排斥反应相关,似乎这些指标可作为诊断生物标志物。据报道,一组六种miRNA(miRNA-9、miRNA-10a、miRNA-21、miRNA-29a、miRNA-221和miRNA-429)可预测同种异体肾移植受者的移植物功能延迟[25]。可见 miRNA作为肾脏同种异体移植状态的生物标志物具有相当大的前景。

特定的蛋白谱α1微球蛋白(α1-MG)在健康的肾脏中自由地穿过肾小球膜,几乎被近端肾小管细胞分解代谢及重新吸收。尿液中高水平的α1-MG表明近端肾小管功能障碍并且与间质纤维化、肾小管萎缩和炎症相关,已知这些是长期移植物丢失的指标。触珠蛋白(HP)主要与游离血红蛋白相结合。Shen等[26]在心脏移植小鼠模型中发现,在IL-6和巨噬细胞炎性蛋白2的高水平表达下,HP可修饰同种异体移植物中的炎症环境,增强树突状细胞移植物募集并增强抗供体T细胞应答,同时免疫抑制性细胞因子IL-10的水平会受到影响。α1-MG和HP在排斥反应预测方面非常有前途的。

趋化因子趋化因子是小分子分泌蛋白组成的一个庞大的细胞因子超家族,在移植物内的免疫细胞募集和定位中发挥重要作用,大量文献表明,尿液趋化因子表达的增加与排斥反应有密切相关性(表1)[27-30]。

表1 尿液趋化因子与器官移植相关性

综上所述,尿液CXCL9和CXCL10预测急性排斥反应、短期移植物功能以及多瘤病毒(BKV)感染的能力较强;虽然尿液CXCL9能鉴别急性T细胞介导的排斥反应,尿液CXCL10在抗体介导的排斥反应中的有着重要的相关性。但是,尿CXCL9和CXCL10仍然无法区分排斥反应和BKV相关肾病(BKVN)。

供者/移植物来源细胞游离DNA

人体内的大多数DNA都位于细胞内,在排斥反应发生之前或期间,同种异体移植细胞受到损伤会导致DNA释放到受者的血液中,从而导致供者来源细胞游离DNA (dd-cfDNA)水平升高。Dale等[31]研究证实，dd-cfDNA的检测在肾移植领域应用优于肾功能检测。当dd-cfDNA<1%,提示未发生ABMR,dd-cfDNA>1%,提示可能发生ABMR(灵敏度59%,特异度85%)[32],BKVN和尿路感染/肾盂肾炎均使dd-cfDNA水平升高,所以添加降钙素原作为感染标志物可提高dd-cfDNA在肾移植排斥反应中的特异度。dd-cfDNA无法区分AMR与BKVN。利用dd-cfDNA进行准确风险分层，对可能发生不良事件的患者进行筛查,有可能改善移植受者的存活率和肾功能预后。

移植物来源的游离DNA (GcfDNA)检测在肝移植领域应用优于肝功能检测和免疫抑制药物监测,而且该值可以通过百分比或绝对拷贝数值进行跟踪[33]。监测GcfDNA具有直接反映移植器官健康的优点。

展 望

免疫状态监测研究方法很多,但尚无公认在敏感度和特异度方面均令人满意的诊断工具。多数研究局限于回顾性或单中心,可复制性差,有些实验方法难以建立统一的标准,或者非常费时费力。目前免疫学监测技术及指标尚未完全满足临床需要,通常需结合多项指标及临床表现进行综合评估。最近一项前瞻性研究[34],纳入72例肝移植受者,收集移植当日到术后21d的外周血,分别监测移植受者外周血中的单核细胞HLA-DR表达、CD4+、CD8+、CD45+、CD64+、IgA、IgG、IgM及NK细胞。术后第3天IgA、IgG和循环单核细胞的增加与感染的发生有相关性。其他指标变化与感染和排斥有关,如移植后第3天和第7天的中性粒细胞。但是这一组普遍的标准化的生物标志物似乎也并不能更好地指导个性化免疫制剂使用。因此,为了满足患者的个性化预测的需求,必须开发可靠的生物标志物用于免疫监测,让高低危排斥反应风险的分层更简便、准确。有助于平衡疗效与不良反应,为移植受者的治疗提供更好的指导,对于提高移植物存活率的个体化治疗至关重要。