牡蛎肽对CCl4诱导肝纤维化大鼠核因子-κB、诱导型一氧化氮合成酶的影响

邓凯翔 黄津

作者单位：1 福建医科大学附属南平第一医院中医康复科，福建 南平 353000

2 福建省第二人民医院感染科，福建 福州 350003

牡蛎肽（Oyster peptide，OP）属性微寒、味咸，具有多种生物功效，包括调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等，在我国中医史籍《千金要方》、《本草纲目》中均有详细记载[1]。有研究发现，牡蛎提取物可以改善酒精性肝病患者的肝脏酶系统，稳定肝细胞膜结构，长期服用可以软化肝脏，具有平肝潜阳、软坚散结之效。现代医学研究也显示，其可以诱导成纤维细胞增殖、活化、凋亡，对不同组织器官均有一定的抗纤维化作用[2]。有研究发现核因子-κB（NF-κB）/iNOS 信号途径在肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）实验方面有重要作用，可以促进HSC 凋亡，减少细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）成分的表达[3]。本研究通过大鼠肝纤维化模型了解牡蛎肽对肝组织NFκB、iNOS 表达的影响并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级SD 大鼠50 只，体重200～220g，由福建医科大学实验动物中心提供[SCXK（闽）2018-0004]，雌雄各半，雌雄分开适应性饲养1 周后采用随机数字表法将大鼠分为5 组，每组10只。实验方案通过我院伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂OP（中国食品工业发酵研究院）；NF-κB p65 抗体、兔抗人iNOS 单克隆抗体（杰圣德生物有限公司，武汉）；CCl440ml+花生油60ml（第四化学试剂厂，天津）；RT-PCR 试剂盒（Sigma 公司，美国）；NO 检测试剂盒（建成公司，南京）。

1.3 分组①正常组（A 组）：腹腔内每周注射3 次等体积生理盐水；②模型组（B 组）：腹腔内每周注射2 次40% CCl4花生油溶液0.2ml/100g；③OP 低、中、高剂量组（C 组、D 组、E 组）：造模同时分别予OP 0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg。采用离体消化分离大鼠HSC，并对细胞活性及纯度进行鉴定[3]。

1.4 方法

1.4.1 免疫组织化学检测肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原 每张切片观察10 个高倍视野，记录显色程度和范围。显色程度用弱、中、强表示；显色范围占高倍视野＜1/4 时记（+）、1/4～2/4（++），2/4～3/4（+++），＞3/4（++++）。将显色程度和范围换算成显色指数，即显色指数=显色程度×显色范围（+、++、+++、++++分别按1、2、3、4 分计算），以10 个视野显色指数的平均数为蛋白表达的显色指数。

1.4.2 吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双重染色检测HSC凋亡 细胞凋亡率计算公式：细胞凋亡率=（凋亡早期细胞数+凋亡晚期细胞数）/细胞总数×100%。

1.4.3 RT-PCR 检测肝组织NF-κB 和iNOS mRNA 提取肝组织总RNA，进行总RNA 纯度分析、cDNA合成，PCR 反应引物序列：iNOS（232bp）上游5'-CGAAAGGGGAATGGATGGC-3'，下游5'-ATTGCAG CGAAGTATTTGAACG-3'；NF-κB（164bp）上游5'-CGGGTTTGAGGCTGCTAT-3'，下游5'-CTCCTTTAC TCCCAGTTCTG-3'；β-actin（202bp）上游5'-GGT AAAACCTGCTATCCAACA-3'，下游5'-GGACTCAT CTCGTACCTGCT-3'。扩增PCR 反应体系，反应条件：94℃预变性1min 30s；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环30 次；72℃延伸5min。以NF-κB/β-actin、iNOS/β-actin 表示mRNA。

1.4.4 Western blot 法检测肝组织NF-κB、iNOS 蛋白肝组织总蛋白的提取：把肝组织剪切成细小的碎片，加入RIPA 裂解液，混匀。RIPA 裂解液在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终溶度为1mM。按常规方法进行蛋白检测，采用增强型化学发光系统显影，结果以NF-κB/GAPDH、iNOS/GAPDH 表示。

1.5 统计学方法采用SPSS 25.0 软件分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达比较A 组汇管区和中央静脉管壁可见少量Ⅰ、Ⅲ型胶原表达。B组汇管区中可见大量Ⅰ、Ⅲ型胶原增生，呈棕褐色。与B 组比较，A 组、C 组、D 组、E 组的Ⅰ、Ⅲ型胶原均减少，差异有统计学意义（Ⅰ型胶原：F=65.32，P＜0.05；Ⅲ型胶原：F=57.49，P＜0.05）；与D 组比较，C 组的Ⅰ、Ⅲ型胶原均增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；C 组、D 组与E 组比较，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达情况（μg/L，±s）

表1 各组Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达情况（μg/L，±s）

注：与B 组比较，aP＜0.05；与E 组比较，bP＜0.05；与D 组比较，cP＜0.05

分组nⅠ型胶原Ⅲ型胶原A 组101.523±0.284a1.278±0.273a B 组106.904±0.4207.952±0.433 C 组105.321±0.312abc4.943±0.367abc D 组103.416±0.312ab3.262±0.239ab E 组102.314±0.352a2.143±0.341a

2.2 各组HSC 凋亡率比较B 组HSC 凋亡率为（3.89±0.59）%，C 组为（5.97±1.46）%，D 组为（21.85±3.98）%，E 组为（32.64±5.06）%。B 组和C 组之间HSC 凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；经中高剂量OP 干预后HSC 凋亡率与其他各组比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 OP 处理前后HSC AO/EB 双重染色结果（×40）

2.3 各组NF-κB 和iNOS mRNA 表达比较A 组NF-κB、iNOS mRNA 仅有少量表达，B 组表达明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。OP 干预组NF-κB、iNOS 表达较B 组明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）；随着OP 剂量的增加，NF-κB、iNOS mRNA 表达逐渐减少，各干预组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2、表3。

表3 各组NF-κB、iNOS mRNA 表达（±s）

表3 各组NF-κB、iNOS mRNA 表达（±s）

注：与B 组比较，aP＜0.05；与E 组比较，bP＜0.05；与D 组比较，cP＜0.05

分组nNF-κBiNOS A 组100.213±0.062a0.328±0.062a B 组101.432±0.2571.731±0.316 C 组100.957±0.203abc 0.889±0.183abc D 组100.513±0.154ab0.613±0.114ab E 组100.291±0.048a0.273±0.053a

图2 各组NF-κB、iNOS mRNA 表达

2.4 各组NF-κB 和iNOS 蛋白表达比较A 组NF-κB、iNOS 蛋白表达较少，B 组表达明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。各OP 干预组NF-κB、iNOS 表达较B 组明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）；随着OP 剂量的增加，NF-κB、iNOS 蛋白表达逐渐减少，各干预组之间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组NF-κB、iNOS 蛋白表达（±s）

表4 各组NF-κB、iNOS 蛋白表达（±s）

注：与B 组比较，aP＜0.05；与E 组比较，bP＜0.05；与D 组比较，cP＜0.05

分组nNF-κBiNOS A 组100.194±0.081a0.102±0.053a B 组101.283±0.1281.101±0.253 C 组100.898±0.189abc 0.752±0.148abc D 组100.449±0.063ab0.497±0.081ab E 组100.212±0.051a0.189±0.065a

3 讨论

OP 是通过肽分子生物技术将牡蛎酶解制作而成，属于小分子低聚肽，完全保留牡蛎原有的营养成分，比氨基酸、蛋白质吸收效率高，在机体代谢方面具有更佳的生物活性，比普通牡蛎制品的生物效价更高[4]。本研究通过AO/EB 染色检测OP 对HSC生长情况的影响，发现OP 具有抑制HSC 凋亡的作用，提示牡蛎小分子肽可能参与肝纤维化的修复。

肝纤维化的主要病理特征是ECM 的过度增生和沉积，HSC 可通过肝细胞、巨噬细胞等旁分泌的NF-κB 刺激转化为肌成纤维细胞，活化、增殖并自分泌NF-κB，进而促进HSC 进一步活化，不断合成ECM，肝纤维化得以持续进展[5]。在HSC 活化早期，NF-κB 可刺激ECM 的合成与分泌，其中主要包括促进Ⅰ、Ⅲ型胶原等的合成[6]。早期临床研究发现肝硬化患者NF-κB 浓度较正常对照组明显增高，同时Ⅰ、Ⅲ型前胶原含量也明显增加，并与NF-κB 呈正相关[7，8]，说明NF-κB 可刺激硬化肝组织合成ECM。

iNOS 在除神经元外的多种细胞中均有表达，催化NO 生成速度慢、量较多，造成细胞和组织损伤[9，10]。本研究免疫组化染色结果显示，模型组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达较对照组明显增高，而OP 干预组表达均较模型组减少，尤其以OP 高剂量组最显著。可推论OP 具有减少细胞外基质成分Ⅰ、Ⅲ型胶原合成，防治肝纤维化的作用。同时检测NF-κB、iNOS mRNA 在各组中的表达，结果显示NF-κB、iNOS mRNA 在模型组中高表达，在OP干预组表达明显减少，模型组与OP 干预组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；同时NF-κB、iNOS蛋白的表达在各OP 干预组之间比较差异也有统计学意义（P＜0.05），说明可能存在剂量依赖性。由以上可知，OP 在减少Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的同时可抑制纤维化肝组织NF-κB、iNOS 的表达。因此，推论OP 可能通过下调NF-κB 和iNOS 的表达，从而减少ECM 的合成，发挥防治肝纤维化的作用。

综上所述，本研究通过细胞组织学、分子生物学等方面研究发现OP 可防治大鼠肝纤维化，具有一定剂量依赖性，经过干预后肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的增生受抑制，其抗肝纤维化机制可能与下调NFκB、iNOS 的表达有关，OP 可介导NF-κB/iNOS 信号通路的发生发展过程。