miR-602、miR-452表达与肝癌术后复发转移及预后的关系研究

靖洁

作者单位：佳木斯市中心医院消化内科，黑龙江 佳木斯 154002

肝癌是一种源自肝上皮组织或间叶组织的恶性肿瘤，发病率位于我国恶性肿瘤第3 位，病死率位于我国恶性肿瘤第2 位[1～3]。肝癌细胞生长活跃，易侵袭包膜和血管，出现局部扩散及远处转移，复发率高，化疗耐药性强，患者预后较差[4～6]，因此早期评估肝癌术后复发转移情况是改善患者预后生存的关键。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一类小型单链RNA 分子，具有高度保守、内源性及非编码的特点，长度为18～24 个核苷酸，在多个蛋白编码基因表达环节中有着重要的调控作用，可参与调控癌细胞增殖、分化、凋亡、转移及肿瘤血管生成等生物学过程[7～9]。miR-602、miR-452 为近期发现的miRNA，在胃癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌等实体恶性肿瘤中表达异常[10，11]，但其与肝癌的关系尚不明确。因此，本研究检测miR-602、miR-452 在肝癌组织及癌旁正常组织中表达情况并分析其差异性，探讨miR-602、miR-452表达与肝癌术后复发转移及预后的关系，以期为临床诊治肝癌提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料经本院伦理委员会批准，选取2014年12月～2018年12月在我院确诊并行手术切除（R0 切除）的原发性肝癌患者72 例，术中收集癌组织及癌旁正常组织。入选标准：①患者经术后病理学检查确诊，术前和术中探查均未见远处转移；②入院之前均未接受治疗的初诊患者；③病历资料完整；④签署知情同意书。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②依从性差；③合并心、肺、肾、脑等重要脏器疾病；④合并精神系统疾病。72 例肝癌患者中男54 例，女18 例；年龄30～78 岁，平均（58.82±6.49）岁；肿瘤直径：＜5cm 33 例，≥5cm 39 例；分化程度：高分化45 例，中低分化27 例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期50例，Ⅲ期22 例。

1.2 研究方法

1.2.1 RT-PCR 法 用总RNA 提取试剂盒（上海瓦兰生物科技有限公司）提取所有患者癌组织及癌旁正常组织中的总RNA，用反转录试剂盒（北京伊塔生物科技有限公司）将其反转录成cDNA，以此cDNA为模板进行PCR 扩增。PCR 扩增体系（总25μl）：cDNA 模板2.0μl，RNase H2O 9.5μl，SYBR Primix Ex Taq 12.5μl，Primer 1.0μl。PCR 反应条件：95℃预变性5min，93℃变性10s，61℃退火延伸30s，40 次循环。PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，以2-△△Ct计算标准化后的miR-602、miR-452 表达水平，其中Ct 为循环阈值，内参为GAPDH。

1.2.2 随访情况 采用电话及门诊检查相结合的方式进行随访，随访内容包括超声、CT、MRI、肝动脉造影等检查。术后第1年每3 个月随访1 次，第2年开始每6 个月随访1 次，随访2年。记录患者随访期间复发与转移、存活情况。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验和Log-rank检验；采用Spearman 检验分析miR-602、miR-452 与肝癌术后复发转移的相关性，ROC 曲线分析miR-602、miR-452 预测肝癌术后复发转移的价值，COX 回归模型及Kaplan-Meier 法分析miR-602、miR-452表达与肝癌术后预后的关系。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁正常组织中miR-602、miR-452相对表达量miR-602、miR-452 在肝癌组织中的相对表达量较癌旁正常组织显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 肝癌组织及癌旁正常组织中miR-602、miR-452相对表达量（±s）

表1 肝癌组织及癌旁正常组织中miR-602、miR-452相对表达量（±s）

组织nmiR-602miR-452癌旁正常组织720.76±0.160.45±0.07肝癌组织723.76±1.203.15±0.98 t 21.02723.318 P＜0.001＜0.001

2.2 未发生和发生复发转移患者miR-602、miR-452相对表达量72 例患者术后随访2年，失访8 例，其中未发生复发转移患者25 例，发生复发转移患者39 例。发生复发转移患者miR-602、miR-452相对表达量较未发生复发转移患者显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.001），见表2。

表2 未发生和发生复发转移患者miR-602、miR-452相对表达量（±s）

表2 未发生和发生复发转移患者miR-602、miR-452相对表达量（±s）

复发转移nmiR-602miR-452未发生251.02±0.780.76±0.64发生394.12±1.473.77±1.15 t-10.978-13.422 P＜0.001＜0.001

2.3 Spearman 相关性分析miR-602、miR-452 均与肝癌术后复发转移呈正相关（r=0.501、0.548，P＜0.001）。

2.4 ROC 曲线分析miR-602、miR-452 单独预测肝癌术后复发转移的价值差异无统计学意义（P＞0.05）；两个指标联合预测肝癌术后复发转移的价值明显优于各指标单独预测（P＜0.05），见表3、图1。

表3 miR-602、miR-452 预测肝癌术后复发转移的价值

图1 miR-602、miR-452 预测肝癌术后复发转移的ROC 曲线

2.5 单因素和多因素COX 回归分析72 例患者术后随访2年，失访8 例，其中生存48 例，死亡16 例。COX 回归分析显示，临床分期及miR-602、miR-452表达上调是肝癌术后预后的影响因素（P＜0.05），见表4。

表4 单因素和多因素COX 回归分析肝癌术后预后影响因素

2.6 Kaplan-Meier 生存曲线分析miR-602 相对表达量＞3.51 患者肝癌术后2年病死率（31.23%）显著高于miR-602 相对表达量≤3.51 患者（7.02%），Log-rank（χ2）=2.436，P=0.038。miR-452 相对表达量＞2.01 患者肝癌术后2年病死率（29.65%）显著高于miR-452 相对表达量≤2.01 患者（10.15%），Log-rank（χ2）=3.321，P=0.017。见图2。

图2 不同miR-602、miR-452 表达水平患者生存曲线

3 讨论

病毒性肝炎、酒精、尼古丁、黄曲霉素污染、有机氯农药、亚硝胺类物质等为肝癌的危险因素，临床中以食欲下降、消瘦乏力、餐后上腹饱胀及肝区疼痛为主要表现[12]。随着人们生活及饮食方式的改变，肝癌发病率及死亡率呈较为明显的增高趋势[3]。手术治疗的进步及放疗、化疗、分子靶向治疗的不断发展，使肝癌患者生存时间有所延长，但术后复发转移仍是临床治疗的难点问题[13]。因此，探究与肝癌发病及其进展有关的生物标志物具有重要意义。

miRNA 调控人体中1/3 左右的基因，在多种恶性肿瘤发病过程中具有关键作用，其与mRNA的非翻译区结合，完全配对时可裂解mRNA，不完全配对时则可抑制mRNA 翻译，引起相应调控蛋白质表达减少，导致疾病发生[14～16]。miRNA 可为促癌分子或抑癌分子，不同的miRNA 在相同或不同肿瘤中发挥着不同的效应[17]。研究发现[18～20]，miR-452 表达下调在胶质瘤中能促进肿瘤细胞干性特征以及肿瘤形成；miR-452 敲减后乳腺癌细胞化疗耐药性显著增加；miR-452 可靶向调控生存素（Survivin）表达来阻碍非小细胞肺癌上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程，最终抑制癌细胞转移。上述研究提示miR-452 在胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌中发挥抑癌效应。本研究结果显示，miR-452 在肝癌组织中呈高表达，并与肝癌术后复发转移及预后不良呈正相关，提示miR-452 在肝癌中可能发挥促癌效应，其促癌作用与以往的研究报道[21，22]相似，即miR-452 能够靶向下调糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）水平，将无翅型MMTV 整合位点家族成员蛋白（Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）通路激活，造成胃癌细胞EMT；miR-452 在肾透明细胞癌患者癌组织中的表达量较癌旁正常组织增加约4 倍，它可能作为促癌基因参与了该疾病的发生。miR-602 为新发现的miRNA 之一，与细胞周期阻滞、血管生成及肿瘤形成等密切相关，miR-602在胆管癌中表达上调，可使该肿瘤细胞对化疗药物如卡培他滨、环磷酰胺等产生敏感性[23]。本研究中，miR-602 在肝癌组织中的相对表达量较癌旁正常组织显著增加，提示miR-602 在肝癌组织中呈高表达，可能参与了肝癌的发生，与既往研究一致[24]，即乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）相关性肝癌患者癌组织中miR-602 表达较正常肝脏组织明显上调，其表达量超过正常肝脏组织的2 倍以上，miR-602在HBV 感染至肝癌进程中具有重要作用。

此外，本研究显示发生复发转移患者miR-602、miR-452 相对表达量较未发生复发转移患者显著增加，Spearman 相关性检验显示miR-602、miR-452 与肝癌术后复发转移呈正相关。同时，COX 回归分析显示除临床分期外，miR-602、miR-452 表达上调也是肝癌术后预后的影响因素；Kaplan-Meier分析显示miR-602、miR-452 表达上调患者术后2年病死率显著升高，提示miR-602、miR-452 与肝癌术后不良预后关系密切，miR-602、miR-452 对肝癌术后复发转移及不良预后具有一定的预测作用。其机制可能为miR-602 靶向调控Ras 相关区域家族1A（Ras related region family 1A，RASSF1A）/Janus激酶（Janus kinase，JAK）通路，进而促进肝癌术后复发。ROC 曲线分析显示，miR-602、miR-452联合预测肝癌术后复发转移的AUC 为0.900，敏感性为92.35%，特异性为88.10%，提示miR-602＞3.51且miR-452＞2.01 时肝癌术后复发转移的风险性较大，两者联合检测对于肝癌患者术后复发转移的预测有较高的临床应用价值。

综上所述，miR-602、miR-452 在肝癌组织中呈高表达，与肝癌术后复发转移及预后关系密切，有望成为肝癌术后复发转移、不良预后评估的候选临床标志物。但本研究样本量不足，随访观察时间较短，且miR-602、miR-452 与肝癌之间的作用机制尚不明确，仍有待进一步研究。