骨肉瘤中微小 RNA 相关的非编码长链 RNA 研究进展

刘昊阳 徐宁 田记超 邵帅铭 刘维宇 杨卫良

骨肉瘤，一种骨组织恶性肿瘤，其结缔组织能直接诱导产生肿瘤骨或骨样组织，常发生于管状骨，例如股骨下端及胫骨上端，且预后不良；主要发生于青少年，在儿童恶性肿瘤中发生率为 5%[1]。近 40 年来，从手术、治疗和放射治疗方面的最新进展来看，骨肉瘤患者的 5 年存活率，已从不足 20% 上升到 70%[2]。张清等[3]统计的 10 年数据证明，患者一旦出现远处组织转移，平均生存时间一般 < 1 年。所以有必要进一步进行骨肉瘤基因水平的研究。近 30 年来，一些 LncRNA 逐渐被发现在骨肉瘤组织中有不同的表达和影响，LncRNA 是没有编码蛋白质功能的一组长度 > 200 个核苷酸的基因编码产物，其在多种肿瘤病情的发展中发挥重要功能；现发现其在不同物种中的自我保守性不稳定，但某些表达重要功能的 LncRNA 中，含有部分高保守元件，这些高保守元件可维持其功能的稳定表达，降低异变性，这可能是一个治疗骨肉瘤的靶点方向[4]。而近年来发现 LncRNA 与 miRNA 存在海绵效应，即 LncRNA 作为 miRNA 的内源竞争性 RNA ( ceRNA )，可像海绵吸水一样将 miRNA 吸附到 LncRNA 的长链上进行调控作用，进而发挥促进或抑制骨肉瘤发展的功能。现就骨肉瘤中 miRNA 关联的长链非编码 RNA 的研究进展综述如下。

一、促进骨肉瘤增殖发展的 LncRNA

最新的许多研究表明，较多 LncRNA 对骨肉瘤的病情发展有促进作用，将其沉默后可达到缓解病情的目的，而其中大部分都与 miRNA 有关。

1. ADPGK-AS1：Luo 等[5]研究发现 ADPGK-AS1 在骨肉瘤组织与细胞中被大量诱导表达，而 miR-542-3p 在同等环境下表达降低；功能实验表明，抑制 ADPGK-AS1 可以促进细胞凋亡。同时 miR-542-3p 被证实是 ADPGK-AS1 的靶向 miRNA，miR-542-3p 表达上调可以逆转 ADPGK-AS1对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的正向作用。但其中详细分子机制尚待进一步研究。

2. LINC00963：Zhou 等[6]经研究发现 LINC00963 在骨肉瘤细胞中高表达。荧光素酶报告基因实验显示，LINC00963 可以通过靶向结合 miR-204-3p 来抑制其表达；此外，研究初步证明了 FN1 ( 纤维连接蛋白 1，Fibronectin-1 ) 是 LINC00963 / miR-204-3p 轴在骨肉瘤中的靶点，FN1 是纤维连接蛋白家族的一个成员，近年来的研究已证明其与多种癌症的侵袭迁移有关[7-8]，但其在骨肉瘤中详细作用机制尚不明朗，综上所述，LINC00963 可通过负向调控 miR-204-3p，并促进 FN1 的表达来增强骨肉瘤细胞的增殖和迁移。

表1 14 种 Lnc RNATab.1 14 kinds of Lnc RNA

3. SND1-IT1：SND1-IT1 在近期研究中被发现在骨肉瘤中过表达[9]。实验发现 miRNA-665 是 SND1-IT1 的靶基因，两者呈负相关，而 POU2F1 ( 第 2 类 POU 结构域转录因子 1 ) 是 miRNA-665 的靶基因，其过表达可导致 DNA异常表达，并且可以促细胞上皮转化 EMT[10-11]，实验发现，miRNA-665 可使 POU2F1 表达水平降低，而 SND1-IT1可促进其表达。由此可初步推测，SND1-IT1 可通过抑制miRNA-665 表达从而上调 POU2F1，加强骨肉瘤的增殖和迁移能力，最终促进骨肉瘤的进展。

4. TMPO-AS1：TMPO-AS1 在近期研究中被发现在骨肉瘤组织和细胞中显著过表达[12]。研究表明，TMPO-AS1可以靶向结合于 miR-199a-5p，且 miR-199a-5p 的过表达可抑制骨肉瘤发展。此外，WNT7B ( Wnt 蛋白家族 7B 抗体 ) 是 Wnt / β-catenin 通路的关键成分之一[13]，其被证实是 miR-199a-5p 的下游基因，过表达可促进组织上皮化，提高细胞异型性。挽救实验表明，在抑制 miR-199-5p 表达的骨肉瘤组织中再度抑制 WNT7B，细胞增殖程度下降，这证明了 WNT7B 的表达被 miR-199a-5p 反向调控。由此可推测 TMPO-AS1 通过负向作用于 miR-199a-5p，增强了 WNT7B 表达，从而促进骨肉瘤的发展，这为临床治疗提供了全新的治疗方向。Liu 等[14]发现 TMPO-AS1 与miR-329 呈负相关，miR-329 与 E2F1 呈负相关；E2F1 是一个关键的细胞内转录因子，是 E2F 家族中第一个克隆的蛋白，其与 EMT 高度相关，因此 TMPO-AS1 可通过负调控 miR-329 来促进 E2F1 表达，进而促进 EMT 的发展，最终导致骨肉瘤发生发展。

5. RP11-361F15.2：RP11-361F15.2 经最新研究发现在骨肉瘤组织中显著升高[15]。研究发现 miR-30c-5p 可负向作用于 CPEB4 ( 胞质聚腺苷酸结合蛋白 4 )，而 RP11-361F15.2 可通过竞争性地结合 miR-30c-5p 来上调 CPEB4的表达，而 CPEB4 在多种人类肿瘤中均有异常表达[16]，且在癌症患者中的异常表达与预后有显著相关性。而在骨肉瘤中，RP11-361F15.2 可通过抑制 miR-30c-5p 使 CPEB4的表达上调，从而促使骨肉瘤细胞迁移侵袭，另外 RP11-361F15.2 还可以诱导 TAMs 极化，研究已证实肿瘤相关巨噬细胞 ( TAMs ) 的极化被认为在肿瘤迁移和侵袭中起关键作用[17]；但关于 RP11-361F15.2 相关的 TAMs 极化方面的详细分子机制尚不明确，应进一步深入研究。

6. PCAT6：Zhu 等[18]研究发现骨肉瘤组织中 PCAT6表达升高，并且 PCAT6 的表达上调与骨肉瘤细胞的转移状态和晚期预后呈正相关。此外 PCAT6 可作为 ceRNA负向调控 miR-185-5p，从而增强 miR-185-5p 的靶向标志物 TGFBR1 和 TGFBR2 的表达，进而激活 TGF-β 通路，而 TGF-β[19-20]在较多肿瘤中都被证明可促进癌细胞增殖侵袭。总之，PCAT6 通过抑制 miR-185-5p 促进 TGF-β 通路表达，从而促进骨肉瘤的发展。有学者发现将 PCAT6过表达后，MDM2E3 ( 泛素蛋白连接酶 ) 表达增加，P53和 P21 水平降低，骨肉瘤的细胞学功能得到促进，下调MDM2 后，骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制[21]。此外，当 MDM2 下调后，P53 和 P21 的表达得到了部分恢复。这些结果表明，PCAT6 通过促进 MDM2 的表达，抑制 P53 和 P21 的表达，从而促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

7. CDKN2B-AS1：CDKN2B-AS1 经近期研究表明在骨肉瘤组织中过表达[22]，研究发现 CDKN2B-AS1 可靶向作用于 miR-4458，而 MAP3K3 经分子机制实验被证实是骨肉瘤中 miR-4458 的下游靶点，并被 miR-4458 负调控；在 CDKN2B-AS1 抑制后的骨肉瘤组织中，MAP3K3 的强制过表达可以部分挽救被抑制的细胞增殖状态。因此，CDKN2B-AS1 通过负调控 miR-4458 增强 MAP3K3 的表达，从而促进了骨肉瘤的进展，但关于 MAP3K3 的详细功能，应进一步研究。Abula 等[23]发现 CDKN2B-AS1 可抑制 microRNA-122-5p ( miR-122-5p )，使细胞周期蛋白 G1( CCNG1 ) 表达升高，进而促进骨肉瘤细胞的增殖。

8. DDX11-AS1：DDX11-AS1 在 Zhang 等[24]的研究下发现其在骨肉瘤细胞中显著过表达。功能缺失实验发现 DDX11-AS1 表达水平降低后，骨肉瘤细胞增殖、转移及上皮 - 间质转化 ( EMT ) 过程遭受抑制；实验证明DDX11-AS1 可以通过抑制 miR-873-5p 来上调骨肉瘤组织中 DDX11 的表达，而 DDX11 已证明与多种肿瘤组织的病情进展有关[25-26]，同时功能试验证明了 miR-873-5p 表达上调可以在骨肉瘤中的细胞增殖、转移和 EMT 过程发挥抑制性作用。此外，DDX11-AS1 在骨肉瘤中通过与 IGF2BP2( 人胰岛素样生长因子 2 mRNA 结合蛋白 2 ) 结合来提高 DDX11 稳定性，而 IGF2BP2 已被证明参与维持多种LncRNA 的稳定，可间接促进肿瘤细胞的生长[27-28]。综上所述，DDX11-AS1 通过抑制 miR-873-5p 上调骨肉瘤组织中 DDX11，并可通过与 IGF2BP2 结合稳定并促使 DDX11发挥功能，从而促进骨肉瘤进展。

9. DANCR：Pan 等[29]研究发现 DANCR 在骨肉瘤组织和细胞系中过表达。功能实验表明 DANCR 的表达下调可诱导细胞凋亡。DANCR 是 miR-216a-5p 的 ceRNA，而SOX5 是 miR-216a-5p 的直接靶点，过表达的 miR-216a-5p通过下调 SOX5 的表达起到抑制细胞增殖的作用。SOX 基因家族是一类 Y 染色体性别决定区 ( SRY ) 相关基因构成的基因家族，SOX5是其家族中一员，与多种肿瘤发展呈正相关[30-32]。总之 DANCR 可通过抑制 miR-216a-5p 上调SOX5 的表达，从而促进骨肉瘤组织增殖侵袭。Wang 等[33]发现下调 DANCR 可抑制 ROCK1 介导的骨肉瘤细胞增殖和转移，并通过负作用于 miR-335-5p 和 miR-1972，促进ROCK1 介导的侵袭转移；ROCK1 ( Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶 ) 高表达可提升肌球蛋白轻链磷酸化水平，增加肌动蛋白和肌球蛋白的收缩力，提升细胞的侵袭能力[34]。

10. FTX：Huang 等[35]发现 FTX 通过调控 TXNRD1 /miR-320a 轴发挥其对骨肉瘤的调控作用，Huang 等经QRT-PCR 实验发现，骨肉瘤中 FTX 和 TXNRD1 表达水平异常上调，而 miR-320a 表达明显下降；荧光素酶报告基因分析显示，FTX 和 TXNRD1 均可与 miR-320a 结合，并可同时抑制其表达，但内在详细的分子机制尚不明确，待进一步深入研究发现。Chen 等[36]发现 FTX 在骨肉瘤组织和细胞系中的表达水平升高，与 miR-214-5p 的表达水平呈负相关。沉默 FTX 后骨肉瘤的生长和转移受到抑制，此过程中 miR-214-5p 表达上升。此外，FTX 还可以通过作用调控 miR-214-5p 进而调节 SOX4 的表达；SOX4 是SRY-BOX 转录因子家族中的一员，已发现其在多种癌症中过表达[37]。综上，FTX 可负调控 miR-214-5p，进而上调SOX4 表达，从而导致骨肉瘤发生发展。

11. KCNQ1OT1：Wang 等[38]经实验发现 KCNQ1OT1在骨肉瘤中的表达上调，分子机制实验表明，KCNQ1OT1可作为 miR-4458 的 ceRNA 抑制 miR-4458 的功能，并增强了 KCNQ1OT1 靶基因 CCND2 ( cyclinD-2 ) 的表达，而 CCND2 与多种肿瘤细胞增殖有关[39-40]。总而言之，KCNQ1OT1 抑制其 ceRNA-miR-4458 的表达，从而使得自我表达增强，同时上调其靶基因 CCND2 的表达，最终使骨肉瘤细胞及组织增殖侵袭能力增强。Huang 等[41]发现下调 KCNQ1OT1 可抑制骨肉瘤中的 Wnt / β-catenin 信号通路。KCNQ1OT1 可以负调控 miR-3666，Kruppel 样因子 7( KLF7 ) 是 miR-3666 的靶基因，当 miR-3666 被下调后，KLF7 表达上升，Huang 等发现，KLF7 过表达后，已抑制的 KCNQ1OT1-Wnt / β-catenin 信号传导得到恢复。总的来说，KCNQ1OT1 通过靶向作用 miR-3666 / KLF7 轴促进骨肉瘤进展并激活 Wnt / β-catenin 信号传导。

12. MIR17HG：MIR17HG 经最新研究发现其在骨肉瘤中过表达，并能提升细胞的顺铂耐药性[42]。分子机制实验发现 MIR17HG 可靶向作用于 miR-130a-3p 和转录因子SP1，并且可以抑制 miR-130a-3p 表达，促进 SP1 表达；SP1 已被证明与多种癌症病情发展相关[43-44]。此外，SP1还可以与 MIR17HG 启动子区再次结合，进一步促进其表达，形成反馈环。这种自有反馈环的分子系统是一个全新的发现，是很有价值的研究方向，有必要继续深入研究。

13. PBB12：PBB12 经近期研究发现在骨肉瘤中表达增加[45]。分子机制研究发现，PBB12 可与 hsa-miR-204-5p竞争性结合，同时 PBB12 可干预 kruppel 样因子 4 ( KLF4 )来激活转录因子 2 ( ATF2 ) 通路，进而增强骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。PBB12 高表达可导致抑癌基因 KLF4 和hsa-miR-204-5p 功能丧失。此外，功能实验数据显示，PBB12 沉默后，KLF4 对肿瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用被显著增强。总之，PBB12 通过抑制 hsa-miR-204-5p 表达，促进自我表达上升并激活 ATF2 通路，抑制 KLF4 的表达，从而促进骨肉瘤发展。

14. MYOSLID：MYOSLID 在最新研究中发现在骨肉瘤组织中高度表达[46]，MYOSLID 被敲除后可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；通过荧光素酶报告基因实验和 RNA 下拉实验，证实了 MYOSLID 与 miR-1286 可直接相互作用，由此推测 miR-1286 是 MYOSLID 的靶标基因。MYOSLID 被抑制后，可促进 miR-1286 在骨肉瘤细胞中的表达，这说明 MYOSLID 的表达与 miR-1286 的表达呈负相关。另外用生物信息学方法以及荧光素酶报告基因实验，证实了 miR-1286 的靶向基因是 RAB13。而 RAB13 是多种癌症的典型致癌基因。因此可认为，MYOSLID 可通过抑制miR-1286 的表达上调 RAB13，从而加快骨肉瘤的进程。

综上所述，LncRNA 作为 miRNA 的 ceRNA ( 内源竞争性 RNA )，可充分发挥其海绵功能，可吸附相关 miRNA进行单向正表达水平的调控，进而通过相关信号通路或因子促进骨肉瘤的发展变化，现已确定 LncRNA 单向调控miRNA，但 miRNA 是否能反作用于 LncRNA，是否可以通过相关通路或细胞因子进行负反馈作用，现在尚不得知，若 miRNA 可靶向负反馈调节 LncRNA，对于临床治疗将有很大意义，这些问题仍须继续深入研究。

二、抑制骨肉瘤增殖发展的 LncRNA

在骨肉瘤中，除了大多数起到促进作用的 LncRNA，另有一些 LncRNA 的表达可抑制骨肉瘤的发展，起到负向作用，现将与 miRNA 相关的该类基因的作用机制列举如下：

1. LINC-PINT：该基因近期研究被发现在多种癌性组织中均有抑制性表达；Liu[47]经研究发现 LINC-PINT 在骨肉瘤组织中表达减低，而在其表达增强的组织中发现miRNA-21 表达下降，由此可见 LINC-PINT 过表达可抑制miRNA-21 表达，实验已证明 miRNA-21 过表达会提高细胞的增殖侵袭性，但 miRNA-21 过表达却对 LINC-PINT 表达无明显影响，这说明 LINC-PINT 对其发挥单向作用的功能。总之，LINC-PINT 可能通过下调 miRNA-21 抑制骨肉瘤发展，而详细的分子机制应进一步深入研究。

2. MEG3：近年研究证明 MEG3 在骨肉瘤组织中异常表达[48]，有明显的抑癌功能，而既往研究表明 MEG3可与 p53 结合，发挥协同正向作用抑制肿瘤发展[49]。而最新研究发现 MEG3 和 miR-361-5p 在骨肉瘤组织和细胞系中同比显著下调，实验发现 MEG3 可直接靶向结合miR-361-5p，显著上调其表达，上调的 MEG3 和 miR-361-5p明显抑制骨肉瘤细胞生长转移，但其中具体的分子机制尚不明朗，尚需进一步查明[50]。

3. SERTAD：SERTAD 基因，被认为是关键的核转录参与者，在细胞增殖及异变性上发挥着重要的调控作用。近期研究发现其与骨肉瘤的发展有关[51]；实验中发现SERTAD2-3 在骨肉瘤细胞中过表达，并可通过诱导细胞G1 期周期阻滞和细胞凋亡来抑制细胞生长；而 miR-29c经研究发现其是 SERTAD2-3 的 ceRNA，且两者的表达呈负相关。实验发现 miR-29c 在骨肉瘤组织中表达上调，并可靶向抑制于抑癌基因 PTEN，提高骨肉瘤细胞的增殖侵袭性，因此初步推测，SERTAD 通过抑制 miR-29c 的表达，促进 PTEN 表达，进而抑制骨肉瘤的发展。

综上所述，LncRNA 作为 miRNA 的 ceRNA，可充分发挥其海绵功能，可吸附相关 miRNA 进行单向负表达水平的调控，从而抑制骨肉瘤的发生发展，但有两个问题：( 1 ) 抑制性 miRNA 相关 LncRNA 较促进性 LncRNA数量要少，这是否和 miRNA 的某些作用有关；( 2 ) 抑制性 miRNA 相关的信号通路和因子未得到深入研究，这是否说明在抑制骨肉瘤的过程中，某些信号通路和细胞因子的功能发挥的较为隐匿或者是消极作用，这些都须进一步研究。

三、LncRNA 及 miRNA 共同作用下的骨肉瘤预后情况

骨肉瘤作为一种预后极差的骨科疾病相关肿瘤，远期的生存率尤为重要，现对于骨肉瘤基因层面的研究仍不完善，探索到抑制骨肉瘤相关 LncRNA 较少，而抑制性 LncRNA 的意义对于骨肉瘤的治疗有着极其重要的作用，但对于强化抑制性 LncRNA 表达后会不会减弱增强性LncRNA 的作用，还须进一步研究证明。而 miRNA 大多数可作为内源性竞争性 RNA 调控 LncRNA 的表达进程，这也是能够改善预后的治疗方向。总之现今骨肉瘤的预后年限虽然上升，但总体不容乐观，仍须继续研究延长患者预后时间。

四、展望

目前，对于参与骨肉瘤病情发展的 LncRNA 的研究日渐广泛及深入，少部分被发现存在抑制性表达，如 SERTAD、LINC-PINT 和 MEG3 等可起到抑癌作用，而大多数 LncRNA 都倾向过表达，如 ADPGK-AS1、LINC00963、CDKN2B-AS1 和 MIR17HG 等都增强了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移性，现是否可将某些高度表达的 LncRNA 作为生物标志物来预测骨肉瘤患者的预后，认为是一个较新的研究领域，这可为治疗方案的制订提供更好的方向，应充分进行发掘研究。此外，还有很多与骨肉瘤相关的 LncRNA 未被发现，即使发现了的 LncRNA 依然尚有很多分子机制不明确，尤其是关于作为内源性竞争性RNA 的 miRNA 的具体调控机制，还须继续研究，所以还需要继续不断的发展分子生物学技术，以求未来对骨肉瘤的治疗提供更多的指导方向，但可以明确的是，LncRNA及 miRNA 在骨肉瘤方面的角色十分重要。