组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂在骨肉瘤分子机制中的作用研究进展

徐红 孙红 杨坤 向阳

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 起源于间叶细胞，是一种最常见于 10～30 岁青少年的原发恶性骨肿瘤，多见于长骨干骺端，具有侵袭性强且易转移等特点[1-4]。目前主要的治疗包括手术结合新辅助化疗，但是存在耐药、转移、复发等问题[5-6]。已发生肺部等远处转移的骨肉瘤患者几乎不可治愈，5 年总体生存率不到 30%[7]，因此骨肉瘤的早期诊断对于患者的预后至关重要。然而目前骨肉瘤的早期诊断却相对局限，临床常用的有影像学检查和血清生化等方法，遗憾的是其特异性和敏感度普遍不高[8]。迄今为止，驱动骨肉瘤细胞增殖和生长的关键机制仍未研究透彻。幸运的是，越来越多的研究表明，组蛋白去乙酰化酶( histone deacetylases，HDAC ) 影响多种细胞过程，并通过多种机制促进骨肉瘤的生长和发展[9]，挖掘其在骨肉瘤发生及进展中的作用机理，对于骨肉瘤的早期诊断、治疗及预后分析等均带来新的希望。组蛋白去乙酰化酶抑制剂( histone deacetylase inhibitors，HDACi ) 通过作用于组蛋白乙酰化酶 ( histone acetyltransferases，HAT ) 和 HDAC，调控细胞核内乙酰化与去乙酰化过程，从而抑制肿瘤细胞周期、诱发 DNA 损伤、诱导肿瘤细胞分化及肿瘤细胞死亡，发挥抗肿瘤作用，逐渐成为肿瘤治疗的新方向[9-11]。现对 HDAC 及 HDACi 在骨肉瘤中的表达及其分子机制作用的研究进展进行综述。

一、HDAC 生物学功能概述

1. HDAC：HDAC 主要存在于真核生物中，是去除赖氨酸残基上乙酰基的一类蛋白酶。现已发现证实的包括 18 种同工型的 HDAC，按照结构差异将其分为四类。Ⅰ 类 HDAC 成员主要由 HDAC1、2、3 和 8 构成，主要位于细胞核中，并在所有组织中普遍表达。Ⅱ 类 HDAC不但分布于细胞核中，而且细胞质中也有表达。分为 Ⅱa类，包括 HDAC4、5、7、9 和由 HDAC6 和 10 构成的 Ⅱb类。Ⅲ 类 HDAC 是沉默调节蛋白 ( Sirtuins ) 同源物，主要由 Sirtuins 1～7 组成[12]，Ⅳ 类 HDAC 目前已探及的仅为 HDAC11[13]。其中 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 类属于称为“金典家族”Zn+ 依赖性酶，Ⅲ 类属于依赖烟酰胺的腺嘌呤二核苷酸 ( NAD+) 酶[14]。

2. HDAC 的作用及功能：HDAC 通过作用于组蛋白、抑癌因子 P53 等细胞因子，直接或间接地参与多种重要的细胞通路，从而影响肿瘤细胞增殖、分化、迁移和凋亡[15]。其在人类肿瘤中普遍存在 HDAC 的异常表达，其可作为肿瘤组织区别于正常组织的分子标志物[16]。主要临床应用有：( 1 ) 肿瘤早期诊断[15]；( 2 ) 肿瘤迁移预测[15]；( 3 ) 肿瘤预后分析[17-20]；( 4 ) 肿瘤的临床治疗[15]。

二、HDACi 生物学功能概述

1. HADCi 概述：HDACi 是一类表观遗传学药物，通过作用于 HDAC 调节基因表达，而无须改变基因序列[10,21]。基于其在体外和体内抑制肿瘤生长的能力，HDACi 在近 10 年中已成为潜在的肿瘤治疗选择[22]。自20 世纪 90 年代至今，人们通过研究已发现了多种结构不同的 HDACi，根据化学结构的特异性，主要分为以下几类：( 1 ) 异羟肟酸类，代表药物有伏立诺他 ( SAHA )、制滴菌素 A ( TSA ) 等；( 2 ) 短链脂肪酸类，如丁酸钠、异戊酸等；( 3 ) 亲电子酮类，目前发现的仅为三氟甲基酮；( 4 ) 环四肽类；( 5 ) 苯甲酰胺类；( 6 ) 其它类化合物。

2. HDACi 功能：靶向抑制 HDAC 已被证实具有抗肿瘤的效应[23]，HDACi 通过抑制 HDAC 的活性而增强组蛋白乙酰化，以促进转录因子与 DNA 链结合，从而启动抑癌基因等特异性基因的表达，基于以上特点，HDACi 主要作用有：( 1 ) 诱导肿瘤细胞死亡 ( 影响细胞凋亡、自噬以及坏死的程序性死亡 )[24-25]；( 2 ) 增加肿瘤细胞对其它抗瘤药的敏感性[26]；( 3 ) 影响活性氧水平[27-28]；( 4 ) 抗血管新生效应[22,29]；( 5 ) 影响细胞因子信号[30]。

三、HDAC 与骨肉瘤

1. HDAC 促进骨肉瘤细胞增殖的分子机制：组蛋白乙酰化和去乙酰化是一个可以逆转的过程，该过程接受 HAT和 HDAC 调节。通过乙酰化作用，去除组蛋白上的正电荷，降低组蛋白 N 末端与 DNA 磷酸基团的相互作用，从而将染色质转化为更松弛的状态。在这种状态下，DNA 更易于访问，这将导致更多的转录因子能够到达 DNA[31]。研究表明组蛋白的乙酰化会增加基因的表达，从而导致基因在涉及增殖，迁移，血管生成和分化的多种途径中表达[11,32]。而组蛋白去乙酰化使 DNA 更紧密地包裹在组蛋白核心周围，使得转录因子不易于与 DNA 相结合，从而使基因的表达水平降低。研究发现：在包括骨肉瘤的许多癌症中已观察到 HDAC 的表达失调可促进癌细胞增殖。随着研究的不断深入，HDAC 在骨肉瘤进展中的重要作用也将逐步被揭示。

2013 年，国外学者研究发现 β-catenin 可作为癌基因和 HDAC6 的底物，在骨肉瘤中，rho 相关的卷曲螺旋激酶通过防止 TPPP1 介导的 HDAC6 活性抑制作用调节β-catenin 的稳定性，从而通过 CK1 和 GSK3β 的磷酸化来减少其乙酰化和降解，进一步促进骨肉瘤的进展[33]。随后国外一项研究表明，HDAC6 / STAT3 通路下调了程序性死亡受体配体 1 ( PD-L1 ) 的表达，从而使 T 细胞中的抑制性调节途径 PD-1 降低，进一步促进肿瘤的进展[34]。最近国内学者在体外试验中又发现 HDAC5 通过上调 Twist 1 的表达促进骨肉瘤细胞系中的细胞增殖[35]。

此后，Deng 等[36]通过临床病例发现：MG63 细胞中的核 HDAC 活性和 Ⅰ 类 HDAC 表达明显高于 hFOB 1.19细胞，达到 3.6 倍，与配对的相邻正常组织相比，在人骨肉瘤组织中观察到了相似的趋势；但是，HAT 活性未见明显差异，从而使 HAT / HDAC 活性比率降低 69%，这些将影响骨肉瘤发病机理中乙酰化的状态，从而影响骨肉瘤细胞的活力。

以上研究均揭示 HDAC 可通过不同分子机制促进骨肉瘤的发生和发展，笔者期望通过寻找某种方式阻断不同的细胞通路来抑制骨肉瘤细胞的增殖与发展，以期在肿瘤的早期进行干预。

2. HDAC 促进骨肉瘤细胞迁移的分子机制：随着近年来新辅助化疗的有序开展，骨肉瘤患者 5 年生存率提高到70% 左右[37]，然而遗憾的是，对于已经发生转移的骨肉瘤患者，5 年生存率仅为 30%[38]，因此迫切的需要掌握骨肉瘤转移机制。

沉默调节蛋白 1 ( sirtuin 1，SIRT1 ) 是一类 NAD+依赖的 Ⅲ 型 HDAC，一项研究分析了 22 例骨肉瘤患者的生存率和转移率与 SIRT1 的关系。结果得出表达高水平SIRT1 的患者的病死率没有增加，表明 SIRT1 的表达水平或许与生存率无关，而 SIRT1 表达水平升高可能与骨肉瘤患者的高转移风险有关。进一步的体外实验证实，SIRT1 的过表达增加了 KHOS / NP，HOS 和 U2-OS 细胞系的迁移能力[39-40]。同时也有学者在横纹肌肉瘤、平滑肌瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤中观察到了强烈的 Sirtuin 1 表达[41]。国外一项研究表明，Sirtuin 1 的过度表达与较高的临床分期，较高的组织学等级，增加的有丝分裂计数和较高的远处转移潜力密切相关，从多变量分析来看，SIRT1的过表达是与骨肉瘤显著相关的独立预后指标，Sirtuin 1的过表达是骨肉瘤患者转移潜能和无病生存的独立预后指标[42]。

通过检测人体骨肉瘤和骨软骨瘤组织中 HDAC4 和增殖细胞核抗原 ( PCNA ) 的 mRNA 及蛋白质的水平，结果显示人骨肉瘤患者临床标本中 HDAC4 和 PCNA 的表达量均明显高于骨软骨瘤患者临床标本；同时在体外实验中，上调人骨肉瘤细胞株 MG-63 和 U2-OS 中 HDAC4，过表达 HDAC4 后，PCNA 的蛋白水平明显升高，而 PCNA的 mRNA 水平无明显变化；另一方面，在过表达 HDAC4后，骨肉瘤细胞的增殖和侵袭明显增强，而细胞凋亡明显减少[43]；以上研究得出，HDAC4 可以使 PCNA 蛋白的表达增加，从而促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，并抑制其凋亡，为骨肉瘤的治疗找到潜在靶点。

3. HDAC 与骨肉瘤预后分析：一项检验 HDAC 在 89例高级骨肉瘤组织中的表达情况的研究表明，HDAC1、HDAC2 和 HDAC3 的三种所有 HDAC 同工型，均主要在骨肉瘤细胞核中表达，原发性骨肉瘤细胞表达较高水平的HDAC1 和 HDAC2，但与良性成骨细胞相比，HDAC3 水平较低。进一步研究表明，HDAC1 的表达水平在 Enneking晚期和初始转移表型显著降低。成人 ( > 15 岁 ) 中 HDAC3的表达明显低于儿童 ( ≤ 15 岁 ) 中的表达。单因素生存分析表明，低水平的 HDAC1 核表达是高级别骨肉瘤的显著阴性预测因子。低 HDAC1 表达的患者 5 年生存率高于HDAC1 表达较高的患者。总体来说，HDAC1 的低表达与不良结局如转移和晚期有关[44]。随着 HDAC 在骨肉瘤细胞迁移中的作用机制的研究进一步深入，对于骨肉瘤的预后分析起到一定的作用。相信随着这方面研究进一步深入，对于骨肉瘤早期转移的控制会逐渐增强，进一步提高骨肉瘤患者的治愈率。

四、HDACi 与骨肉瘤

骨肉瘤细胞的程序性死亡在骨肉瘤发生、进展及临床治疗中均可发挥重要作用。研究表明，HDACi 可以显著影响骨肉瘤细胞的凋亡、坏死和自噬等关键的程序性死亡途径。

1. HDACi 诱导骨肉瘤细胞凋亡的机制：凋亡是介导骨肉瘤细胞死亡的主要途径，且与化疗药物耐药率的高低存在一定联系[45]。研究表明，HDACi 在骨肉瘤细胞的凋亡途径中可起到诱导作用。在骨肉瘤中，Bcl-2 / Bax 被认为是最关键的调节凋亡通路之一[46]，Bax 与 Bcl-21 两者都属于 Bcl-2 家族蛋白，分别属于最主要的凋亡蛋白及抗凋亡蛋白[47]。国内学者证实 SAHA 联合顺铂可通过协同靶向Bcl-2 / Bax 促进骨肉瘤的增殖抑制，诱导其凋亡[48]。一项体外实验发现，TSA 通过 p53 信号通路激活以剂量依赖的方式显著抑制 MG63 细胞的生长并促进凋亡[36]。而进一步研究表明[49]，HDACi 能够通过 p53 的信号传导途径或内在线粒体途径诱导的骨肉瘤细胞的凋亡，这种有效的凋亡活性与 HDACi 通过 AKT ( 蛋白激酶 B，也称为 PKB ) 下调生存信号的更大能力有关[50]。

2. HDACi 诱导骨肉瘤细胞自噬：近年来研究发现，HDACi 在细胞自噬调控过程中也能发挥作用，但其具体作用机制还需进一步深入，是目前研究的热点之一。

一项研究表明，曲古抑素 A ( TSA ) 处理可抑制雷帕霉素 ( mTOR ) 信号转导途径的哺乳动物靶点，并增强叉头盒 O1 ( FOXO1 ) 的转录活性，导致自噬水平提高，而通过 siRNA 敲除抑制 FOXO1 功能则可显著降低 TSA 诱导自噬。而通过自噬抑制剂或 ATG 基因敲低抑制自噬，可显著增强 TSA 引起的细胞死亡，揭示了自噬在 HDACi 引起的骨肉瘤细胞死亡中的功能是一种细胞存活机制，HDACi能够阻断 AKT-mTOR 信号传导并抑制癌细胞存活率和迁移，因此通过结合 HDACi 和自噬抑制剂成为骨肉瘤治疗中的一个新的方向[51]。

3. HDACi 诱导骨肉瘤细胞坏死：坏死也是细胞程序性死亡的一种方式。然而只有在 Caspase 抑制剂抑制凋亡途径时，活化的死亡受体才会将细胞坏死途径激活，从而介导细胞死亡。一项研究表明，HDACi 可能通过诱导骨肉瘤细胞上的 NKG2D 配体 MICA / B 上调以及增加自然杀伤细胞上 NKG2D 受体的表达来增强癌细胞对自然杀伤细胞的识别[52]，通过这一途径，促进骨肉瘤细胞坏死。

4. HDACi 在骨肉瘤中的其它作用机制：HDACi 增强了骨肉瘤和 RMS 细胞系的辐射作用，暴露于 HDACi 后，DNA 修复的抑制以及凋亡诱导的增加可能是 HDACi 引起放射增敏的机制[53]。Ⅰ 类 HDAC 抑制剂 MS-275 可增强骨肉瘤细胞对活性氧 ( ROS ) 的脆弱性，通过增强 YB-1 乙酰化作用，抑制了关键细胞保护因子的 YB-1 转化控制及其促转移活性，从而限制骨肉瘤的转移[54]。AR-42 与阿霉素的组合可有效抑制细胞活力并产生明显的协同作用[49]。SAHA 和顺铂的组合通过调节细胞周期抑制骨肉瘤细胞增殖，使得细胞迁移速率显著降低[48]。Blattmann 等[55]通过皮下注射 KHOS-24OS 细胞建立骨肉瘤异种移植物，并用媒介物 ( DMSO )，SAHA，HIT ( 重离子放射疗法 ) 或 HIT和 SAHA 进行处理，确定肿瘤生长并评估肿瘤坏死，增殖率，凋亡率以及血管密度，证实 HIT 和 SAHA 的组合通过增加凋亡率，增加 p53 和 p21 Waf1 / Cip1 的表达，抑制增殖和血管生成，诱导了肿瘤生长的显著延迟。国内学者阿吉木·克勒木等通过体内和体外实验研究得出，HDAC6通过激活 STAT3 通路下调了骨肉瘤细胞表达的重要共刺激分子程序死亡受体配体-1 ( PD-L1 ) 的表达，激活了 T 细胞的抑制性调节通路 PD-1，从而抑制体内肿瘤的进展，这为骨肉瘤的免疫治疗提供了新的思路[34]。

五、总结与展望

总的来说，HDAC 在骨肉瘤中发生及进展中意义重大，愈来愈多的研究表明其在骨肉瘤中的表达水平较正常组织中高，通过研究不同类型的 HDAC 在骨肉瘤中的表达情况，可以尽早在骨肉瘤早期预测抑或是检测出骨肉瘤，以便于早诊断、早治疗，这对于骨肉瘤患者来说意义重大。HDACi 在骨肉瘤中有跨越细胞途径的广泛生物学效应，包括骨肉瘤中的凋亡、坏死、自噬、细胞分化和 ROS生成，这些机制表明，HDACi 可能是骨肉瘤患者有前途的治疗剂之一，并为 HDACi 在骨肉瘤中的临床应用中奠定了基础。此外，研究表明，HDACi 不但使骨肉瘤对放疗和化疗敏感，而且还在骨肉瘤中联合化疗药物或其它靶向药物时可以提高治疗效果，这极大地改善了放化疗不敏感类型骨肉瘤患者的治疗窘境。虽然 HDACi 在骨肉瘤的治疗中表现显著，但是问题也同样存在，例如 HDACi 精准性不够高，无法调节细胞信号中的细微差别，这也带来了无法精准识别的问题，从而在肿瘤不同亚型中效果不尽相同，甚至起到反作用的可能。相信通过国内外学者的不断研究，HDACs 在骨肉瘤中表达机制会进一步揭露，为骨肉瘤的早期诊断与预后疗效预测提供更多的便利。同时，HDACi 的不断推广，通过联合化疗药物或其它靶向药物，将会为骨肉瘤患者带来更多的福音。