苏云金芽孢杆菌LLP29菌株中ykkB基因的克隆、表达及活性分析

杨兆辉, 汪子洋, 杨文涛, 蔡瑜婷, 谭伟龙, 黄恩炯, 张灵玲

(1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2.东部战区疾病预防控制中心，江苏 南京 210002；3.福州国际旅行卫生保健中心，福建 福州 350001)

蛋白质乙酰化是一种重要的翻译后修饰方式，广泛发生于细胞内各种生化反应进程中，与许多生物功能相关.真核生物中有80%～90%的蛋白质发生了乙酰化修饰，原核生物中也广泛存在该种修饰方式.例如：Chunaram et al[1]发现,乙酰化存在于细胞各处，参与细胞增殖、mRNA剪切、蛋白质合成等过程；人体代谢酶也发生了许多乙酰化修饰，基因调控、糖代谢、TCA循环、尿素循环、脂肪酸循环等生化进程均受到乙酰化调控，以适应不同的环境状态[2-3]；Kumar et al[4]发现,在利什曼原虫(Leishmaniaspp.)中组蛋白发生乙酰化修饰会影响细胞的活力.HAT3是一种组蛋白乙酰转移酶，能介导增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)发生乙酰化修饰，而PCNA在DNA复制及受损修复进程中起着重要的作用.当HAT3被清除时，细胞生长速度明显下降，且经相同紫外光照射处理后细胞数量远远小于有HAT3基因的菌株，说明乙酰化作用的丧失会影响细胞的稳定性和修复能力.

乙酰基转移酶可催化乙酰辅酶A(AcCoA)上的乙酰基向蛋白质N-末端丙氨酸残基的α-氨基上转移，从而让蛋白质在翻译过程中或翻译结束后发生可逆或不可逆的修饰[5-6].Liew et al[7]发现，核糖体蛋白乙酰化程度的降低会抑制蛋白质的合成，且核糖体蛋白乙酰化会在起始复合物形成时发生；Vetting et al[8]发现,核糖体蛋白S5的乙酰化修饰可以在一定程度上抑制核糖体蛋白S4的基因突变；李淑娴[9]发现,几乎所有的核糖体蛋白都具有乙酰化修饰，暗示核糖体蛋白对乙酰化修饰具有偏好性，且乙酰化修饰会调控核糖体的合成，影响核糖体的组装.

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)是一种革兰氏阳性细菌，可通过编码杀虫晶体蛋白对多种昆虫起毒杀作用，是目前研究最深入、应用最广泛的微生物杀虫剂[10].然而，当前有关Bt蛋白乙酰化修饰的报道较少.本课题组在前期研究中获得了一株高效杀蚊Bt新菌株LLP29[11]，通过对该菌株基因组进行测序分析，发现其存在可能编码一种乙酰基转移酶的ykkB基因，但该基因在Bt中是否可通过对Bt蛋白的乙酰化修饰影响菌株生物学特性还不得而知.因此，本研究以ykkB基因为靶标，克隆、表达该基因，并通过生物信息学分析该基因的序列特征，为进一步明确ykkB基因在Bt中的功能提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 LLP29菌株总DNA提取

将Bt LLP29甘油菌以1%接种量转接至5 mL LB培养基中，30 ℃、150 r·min-1培养过夜，12 000 r·min-1离心2 min分离菌体，使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取Bt LLP29总DNA.

1.2 ykkB基因的克隆

根据课题组前期研究得到的LLP29菌株基因组信息，添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，设计ykkB基因特异性上游引物ykkB-F1(5′-CCATGGCTGATATCGGATCCATGCATACAAAACATGATCGTGAA-3′)和下游引物ykkB-R1(5′-CGACGGAGCTCGAATTCTCATCCAACACGTTTAATGGAATAAAC-3′)，以Bt LLP29总DNA为模板，55 ℃为退火温度，体外扩增ykkB基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.以BamHⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点通过酶切pET-32a构建克隆连接载体，再通过全式金无缝克隆试剂盒将线性载体与ykkB基因目的片段连接，然后热激转化进EscherichiacoliTrans1-T1菌株.阳性克隆子通过PCR及单双酶切验证，并将验证正确的pET-32a-ykkB-T1质粒委托福州白鲸生物技术有限公司测序.

1.3 ykkB基因生物信息学分析

利用NCBI中的开放阅读框查找器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)将ykkB基因序列转化成氨基酸序列后，通过MEGA 7.0软件构建系统发育树；利用ExPASy中的ProtParam功能(https://web.expasy.org/protparam/)对YkkB蛋白序列进行氨基酸组分分析；利用ExPASy中的ProtScale功能(https://web.expasy.org/protscale/)对YkkB蛋白进行亲水性分析；利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对YkkB蛋白进行跨膜域分析.

1.4 YkkB蛋白的表达

将1.2中构建的pET-32a-ykkB-T1菌株质粒热激转化进E.coliBL21菌株，阳性克隆子通过PCR及单双酶切验证，并将验证正确的pET-32a-ykkB-T1-BL21质粒委托福州白鲸生物技术有限公司测序.参考张迹等[12]的方法，将验证成功的pET-32a-ykkB-T1-BL21置于1‰AmpLB液体培养基中，37 ℃振荡培养至D600 nm约为0.6，然后加入50 μL 100 mg·mL-1IPTG，16 ℃诱导20 h.根据陈凡冰等[13]的方法提取总蛋白，用SDS-PAGE电泳检测.

1.5 体外自乙酰化试验

参考孙曼銮[14]的方法，以乙酰辅酶A作为乙酰基供体，在离心管中分别加入200 μL 1 mg·mL-1纯化后的YkkB蛋白和50 μL 5 mg·mL-1的乙酰辅酶A(对照组添加200 μL纯化后的YkkB蛋白和50 μL 50 mmol·L-1Tris-HCl)，将样品混合均匀，37 ℃反应3 h.反应结束后通过SDS-PAGE分离样品，并使用泛乙酰化抗体为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠为二抗，通过Western Blot检测YkkB蛋白的乙酰化修饰程度.

2 结果与分析

2.1 ykkB基因的克隆

根据ykkB基因序列设计特异性引物，以Bt菌株 LLP29总DNA为模板PCR扩增目的基因，通过电泳检测，获得一条大小约为600 bp的目的条带(图1A)，与预期一致，说明成功获得ykkB基因PCR扩增产物.

将ykkB基因PCR产物转化于E.coliTrans1-T1，提取阳性克隆子pET-32a-ykkB-T1质粒DNA，通过PCR验证，同样获得一条大小约为600 bp的条带(图1B)；用限制性内切酶QuickCutBamHⅠ对阳性克隆子质粒进行单酶切验证，获得一条大小约为6 500 bp(载体与目的基因之和)的条带(图1C泳道2)；用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切验证，分别获得大小约为5 900和600 bp的条带(图1C泳道3).将提取成功的pET-32a-ykkB-T1质粒委托福州白鲸生物技术有限公司，以pET-32a通用引物T7 Terminator单项测通，测序结果经NCBI的BLAST进行比对，结果发现测序序列与目的序列同源性高达100%.以上结果说明ykkB基因已成功克隆.

A.ykkB基因的PCR扩增(M:200 bp DNA ladder;泳道1:阴性对照；泳道2:ykkB基因)；B.pET-32a-ykkB-T1质粒的PCR验证(M:200 bp DNA ladder;泳道1:ykkB基因)；C.pET-32a-ykkB-T1质粒的酶切验证(M:DL15 000 DNA ladder;泳道1:pET-32a-ykkB-T1-BL21质粒;泳道2:pET-32a-ykkB-T1质粒单酶切;泳道3:pET-32a-ykkB-T1质粒双酶切).

2.2 生物信息学分析

2.2.1ykkB基因家族的同源进化分析 利用NCBI中的开放阅读框查找器将ykkB基因序列转化成氨基酸序列，再用NCBI中的Blast对Bt LLP29菌株中YkkB蛋白进行同源性比对，并选取不同菌株中的同源序列用MEGA 7.0软件构建进化树，设置1 000 bootstrap引导程序值检验进化树.结果显示，Bt LLP29-ykkB与WP 141526681.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacilluscereusgroup和WP 003263049.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacillus菌株的距离最近(图2)，表明Bt菌株中ykkB基因与这两个基因的亲缘关系较近，可能是一类N-乙酰转移酶.

图2 Bt菌株LLP29中ykkB同源进化分析

2.2.2 YkkB蛋白理化性质预测 利用ExPASy中的ProtParam对Bt中YkkB蛋白进行分析发现，YkkB蛋白的分子质量约为21.58 ku.氨基酸组成分析表明：YkkB蛋白中含量最多的是赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)，均有18个，占比9.63%；含量最少的是半胱氨酸(Cys)，有1个，占比0.53%；酸性氨基酸数量为19个，占比10.16%；碱性氨基酸数量为34个，占比18.18%；亲水性氨基酸数量为44个，占比23.53%；疏水性氨基酸数量为90个，占比48.13%；负电残基(Asp+Glu)的总数为19个；正电残基(Arg+Lys)的总数为28个(表1).通过等电点分析，预测YkkB蛋白的等电点为9.52；分子式为C982H1535N265O269S7，总原子数为3 058 mol；不稳定指数为28.28，是一种稳定蛋白；脂肪指数为86.58；平均吸水性(GRAVY)为-0.384.

表1 Bt菌株LLP29中YkkB蛋白氨基酸组成分析

2.2.3 氨基酸疏水性、跨膜区预测 通过ExPASy中的ProtScale并使用Kyte & Doolittle算法对Bt中YkkB蛋白进行亲水性分析，发现其最大值为2.067，最小值为-2.822(图3)，即YkkB为一种亲水性蛋白质；利用TMHMM Server v.2.0在线工具对YkkB蛋白进行跨膜域分析，发现YkkB蛋白无跨膜区，约有56%的可能性在膜外(图4).

图3 Bt菌株LLP29中YkkB的亲水性分析

图4 Bt菌株LLP29中YkkB的跨膜区分析

2.3 YkkB蛋白的表达、纯化

构建ykkB基因表达载体并将该基因转化至E.coliBL21，将成功转化的pET-32a-ykkB-T1-BL21和仅转化了空载体的pET-32a-BL21扩大培养至D600 nm为0.6时加入IPTG，16 ℃诱导培养20 h，经镍柱亲和层析纯化后将其通过SDS-PAGE验证，获得一条大小约为39 ku的条带(图5).这与预期一致，说明YkkB蛋白表达成功.

M:蛋白预染Marker;泳道1:YkkB蛋白;泳道2:pET-32a空载.

2.4 体外自乙酰化试验结果

以乙酰辅酶A为乙酰基供体，将表达纯化后的YkkB蛋白与乙酰辅酶A体外结合，并通过Western Blot检测YkkB蛋白的乙酰化修饰情况.结果发现，YkkB蛋白与乙酰辅酶A体外结合后蛋白乙酰化修饰程度加强(图6).由此可见，YkkB蛋白可接受乙酰基供体提供的乙酰基，其可作为一类乙酰基转移酶发挥作用.

3 小结

乙酰化是目前研究较多的一种蛋白质翻译后修饰途径，其是在乙酰基转移酶的催化下通过转移乙酰基供体让蛋白质在翻译过程中或翻译结束后发生修饰，从而改变蛋白质的稳定性或使生物快速响应并适应不断变化的环境[15].Ramagopal et al[16]发现,稳定期E.coli核糖体蛋白L12的N端乙酰化程度比对数生长期高，说明乙酰化修饰在修复老化细胞方面有一定作用.然而，Bt赖氨酸2，3-氨基变位酶kamR调控的基因可能与孢子形成有重要关联[17].

本课题组前期对Bt LLP29菌株的基因组进行测序分析，发现该菌株编码ykkB基因.通过基因注释发现其可能是一个编码乙酰基转移酶的基因.为了解BtykkB基因的功能，本研究通过克隆技术成功将其克隆至E.coliTrans1-T1.通过测序分析发现该蛋白赖氨酸和亮氨酸含量最高，说明作为乙酰基直接作用的氨基酸位点，YkkB多样的赖氨酸和亮氨酸位点可对乙酰基结合及蛋白的乙酰化修饰发挥重要作用.通过基因同源性比对发现，ykkB基因存在于多种生物体内，包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、热带芽孢杆菌(B.tropicus)等.其中，Bt LLP29-ykkB与WP 141526681.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacilluscereusgroup和WP 003263049.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacillus的亲缘关系最近.通过理化性质分析发现，YkkB蛋白是一种稳定的亲水性蛋白质，无跨膜区，且有较大概率存在于膜外，说明水溶性的YkkB蛋白可为更多的蛋白乙酰化修饰提供可能.本研究还成功表达、纯化了YkkB蛋白，将其与乙酰辅酶A体外结合并通过Western Blot分析发现，YkkB蛋白的乙酰化修饰程度有所加强，说明该蛋白有接受乙酰基的能力，可以通过向底物提供乙酰基发挥乙酰基转移酶作用.但是，YkkB具体如何在Bt菌株中通过乙酰化影响其生理生化反应，还需进一步探讨.