印度梨形孢和FocTR4对香蕉根系微生物群落结构的影响

刘 范, 王 斌, 伍俊为, 武 欢, 刘嘉鹏, 田 娜, 黄玉吉, 程春振,2

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801)

微生物广泛存在于植物根系和土壤中，是二者进行物质循环转化的重要推动者[1].植物通过根系分泌物引起微生物富集，改变土壤环境，形成“根系-微生物-土壤”微生态系统[2-3].根系微生物能调控植物对营养物质的吸收能力、参与根系能量代谢以及影响植物的生长发育[4]；同时，根系微生物会产生次生代谢产物，抑制土壤病原菌的入侵，提高植株对生物胁迫的抗性[5-6].微生物组成的动态平衡是保证根系微生态系统稳定、维持植物正常生长的必要条件[7].因此，探究根系微生物群落结构、分析优势菌群变化情况对于了解植物-微生物互作机理具有重要意义.

香蕉是世界上最重要的果树之一.近年来，香蕉产业的发展受到由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariurmoxysporumf.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病的严重影响[8].香蕉枯萎病菌是一种土传性真菌，该病菌潜伏期长，且能在较低孢子浓度下引起病害，目前尚无彻底根治该病的方法[9].通过生物菌肥防控香蕉枯萎病已取得一定进展.研究表明，外施含有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、绿色木霉菌(Trichodermaviride)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的生物有机肥均能显著降低香蕉枯萎病的发生率[10-12].生物菌肥能改善土壤养分和结构，改变优势菌群的构成，提高有益微生物的多样性，进而降低香蕉枯萎病菌的丰度[13].

印度梨形孢(Serendipitaindica)是Verma et al[14]在印度沙漠地区灌木丛根部分离到的一种类丛枝菌根真菌，其能广泛定殖于植物根部并与植物形成共生结构，且可以纯培养.该菌的定殖能提高宿主根系对养分的吸收能力，促进宿主生长发育，增强其对逆境的耐受性[15].Madaan et al[16]将S.indica应用于香蕉，发现其可以显著促进香蕉生长和提高香蕉产量；Li et al[17]发现，S.indica能够促进香蕉组培苗生根和叶片光合色素合成；Bodjrenou et al[18]发现，S.indica可以提高香蕉抗热性.此外，有研究发现，S.indica能在一定程度上提高香蕉对枯萎病的抵抗能力，推迟病症的显现时间[19-20].目前，有关S.indica对香蕉枯萎病菌影响的研究主要集中在真菌拮抗、香蕉抗病基因表达以及转录组分析等方面[19-20]，针对S.indica和枯萎病菌对香蕉根系微生物群落影响的报道较少.本研究通过宏基因组测序技术分析了接种S.indica和Foc热带4号小种(FocTR4)后香蕉根系微生物群落结构的差异，以期从宏基因组水平揭示它们对香蕉根系微生物群落的影响，为进一步利用S.indica防控香蕉枯萎病、发掘生防菌株提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料及其处理

本试验所用的‘天宝蕉’组培苗及S.indica(DSM11827)和FocTR4菌种均由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供.选取四叶一心、长势均匀一致的培养于苔藓泥炭土基质(PINDSTRUP，丹麦)的‘天宝蕉’移栽苗接种S.indica，即在香蕉根系附近灌入50 mL孢子悬浮液(浓度为1×105个·mL-1)，为了保证S.indica的定殖率，每隔1 d浇一次菌液，总共3次；对照组用等体积稀释相同比例的PDB溶液处理[17].2周后，参照Li et al[17]的方法检测S.indica定殖情况.之后将对照组和S.indica定殖组的香蕉苗进一步分为2组：一组参照左存武等[21]的方法接种FocTR4(形成F+、SF组)，每100 g土壤浇孢子浓度为 5×105个·mL-1的FocTR4悬浮液100 mL；另一组浇等体积稀释相同比例的PDB溶液(形成CK、S+组).接种2个月后取根系，将根系置于自来水下冲洗去除土壤，再使用无菌水冲洗1 min，冲洗3次，然后将根系放入超声波清洗机中洗涤5 min，再用无菌水冲洗3次后使用无菌滤纸吸干表面水分[22]，液氮中速冻后保存于-80 ℃冰箱中备用.每个处理组3个生物学重复.

1.2 宏基因组提取

为减少植株个体差异对宏基因组测序结果的影响，本研究参照Kaushal et al[23]的方法将各处理组3个重复的香蕉根系混合后采用PowerPlant Pro DNA Isolation Kit试剂盒提取香蕉根系总DNA.通过1%琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白检测仪分别检测完整性和浓度后，送至深圳华大基因股份有限公司进行宏基因组的文库构建，使用Illumina HiSeqXten测序平台进行双末端测序.

1.3 高通量测序与数据分析

根系宏基因组原始数据经过质控和过滤后，使用SOAPdenovo2和Rabbit软件进行de novo组装，然后利用MetaGeneMark和CD-Hit软件进行基因预测和聚类分析，获得非冗余基因集；使用Blast程序对所有预测到的基因进行搜索比对，得到基因功能注释信息；通过MEGAN软件分析nr数据库的比对结果，获得所有基因的物种注释信息，进而得出样品中物种的丰富程度；同时，利用Shannon指数分析各样品的物种多样性.

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel(Office 2019)软件分析数据.利用TBtools软件绘制物种丰度热图和Venn图[24].

2 结果与分析

2.1 香蕉接种S.indica和FocTR4后的表型

接种S.indica2周后，使用台盼蓝染色法鉴定S.indica在香蕉根系的定殖情况.从图1A可知，浇灌S.indica孢子悬浮液的香蕉根系中可观察到典型的梨形厚垣孢子，表明S.indica已经成功定殖于香蕉根系.

接种FocTR4 2个月后，F+组香蕉植株出现较明显的枯萎病症状，叶鞘呈橙黄色，叶片枯黄；而SF、CK及S+组植株表型差异不大，虽有部分叶片衰老黄化，但未见明显枯萎病症状(图1B).这说明S.indica能推迟香蕉枯萎病症状的显现.

A中红色箭头标记处为S.indica；B中从左到右依次为CK(接种PDB溶液)、S+(接种S.indica悬浮液)、SF(接种S.indica和FocTR4悬浮液)和F+(接种FocTR4悬浮液)组植株.

2.2 香蕉根系宏基因组测序结果

经宏基因组测序，CK、S+、F+和SF组分别获得65 313 994、55 514 680、68 872 022和62 045 516条原始序列，去除不合格序列和宿主序列后分别得到57 836 368、49 726 978、59 298 254和55 451 110条有效序列.各组有效序列比例均高于86.00%，表明样品测序结果良好(表1).将有效序列进行de novo组装获得contig后用于基因预测和基因集的构建，得到含有67 194个基因的非冗余基因集.其中：F+组中预测的基因数量最多，达42 365个；S+组中预测的基因数量最少，仅22 218个.

表1 香蕉根系宏基因组测序数据1)

2.3 物种注释分析和群落多样性

将CK、S+、F+和SF组的基因与nr蛋白数据库进行序列比对，分别有30 595、18 962、33 922和34 448个基因注释到蛋白功能(表2).通过MEGAN分析各组基因的物种信息发现，CK组的物种种类最多(1 610种)，SF组次之(1 531种)，S+组物种种类最少(1 112种).Shannon指数反映微生物群落的多样性，指数越大，说明物种越多样.各组样品的Shannon指数排序为CK(2.07)>S+(1.83)>F+(1.63)>SF(1.23).

表2 香蕉根系宏基因组物种注释统计1)

2.4 香蕉根系优势菌群组成

2.4.1 门分类水平上的优势菌群 在门分类水平上，CK组含有的优势菌门(占比≥0.50%)数量最多，高达9个；S+组次之，有8个；而SF组仅含有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)4个优势菌门(表3).在各组根系中，变形菌门(35.11%～86.68%)、放线菌门(0.82%～46.17%)和厚壁菌门(1.21%～27.22%)占比均较高，但不同样品之间差异明显；而蓝菌门(Cyanobacteria，0.40%～7.47%)、纤维杆菌门(Fibrobacteres，0.03%～3.67%)、拟杆菌门(0.31%～8.03%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，0.05%～1.06%)、螺旋体门(Spirochaetes，0.04%～0.61%)、浮霉菌门(Planctomycetes，0.04%～0.54%)和绿藻门(Chlorophyta，0.03%～0.76%)占比均较低，且不同样品之间差异小.

表3 门分类水平上优势微生物群落组成及其占比1)

进一步分析发现，接种S.indica和FocTR4明显改变了香蕉根系优势菌门占比.变形菌门在CK组占比为35.11%；而在S+和F+组占比分别达到43.70%和41.27%，为CK组的1.24和1.18倍；在SF组占比最高(86.68%)，约为CK组的2.47倍.这说明接种S.indica和FocTR4均提高了变形菌门的相对丰度，同时接种这两种真菌时变形菌门富集最显著.放线菌门在SF组的占比最低，仅为0.82%，但在CK组和F+组的占比分别高达25.03%和46.17%.厚壁菌门在S+组(27.22%)的占比约为CK组(13.82%)的1.97倍，而在F+和SF组的占比分别比CK组降低了66.93%和91.20%.这说明接种S.indica可以提高厚壁菌门在香蕉根系中的相对丰度，而接种FocTR4会降低该菌门的相对丰度.

2.4.2 属分类水平上的优势菌群 在属分类水平上，香蕉根系微生物群落的优势菌属(占比≥0.50%)有25个，分布于8个门(表4，图2).S+组的优势菌属数量最多，达到15个；F+和CK组次之，分别为11和10个；而SF组的优势菌属数量最少，为9个.拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis，0.01%～12.21%)、葡萄球菌属(Staphylococcus，0.96%～26.24%)、链霉菌属(Streptomyces，0.58%～44.38%)和根瘤菌属(Rhizobium，0.73%～58.91%)在各组中是主要的分类群.其中：CK组的拟无枝菌酸菌属占比最高，达到12.21%，而该属在其他组中占比均低于0.50%；葡萄球菌属在S+组的占比最高(26.24%)，但接种FocTR4后该属的占比显著降低(仅占0.96%)；链霉菌属在F+组为最优势菌属，占比高达44.38%，为CK组(8.28%)的5.36倍；根瘤菌属在SF组的占比达到58.91%，远高于该处理组中的其他优势菌属.

表4 属分类水平上优势微生物群落组成及其占比1)

聚类分析发现，香蕉根系优势菌属主要分为5个分支(图2).链霉菌属、鞘脂菌属(Sphingobium)、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)5个优势菌属主要在F+组富集.SF组中根瘤菌属、农杆菌属(Agrobacterium)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、鞘脂杆菌属(Pedobacter)和中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)的相对丰度较高.拟无枝菌酸菌属、纤维杆菌属(Fibrobacter)、Chitinispirillum和堆囊菌属(Sorangium)在CK组富集.葡萄球菌属、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、硫碱弧菌属(Thioalkalivibrio)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、艾克曼菌属(Akkermansia)、Rudaea、杆状病毒属(Badnavirus)和盐藻属(Dunaliella)8个优势菌属主要集中在S+组.假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)在各组中的相对丰度无明显差异.

CK:接种PDB溶液;S+:接种S.indica悬浮液;F+:接种FocTR4悬浮液;SF:接种S.indica和FocTR4悬浮液.同一行上，橘色色块代表相对丰度较高，蓝色色块代表相对丰度较低.

进一步以各处理条件下菌属的种类与数量绘制韦恩图(图3)，发现CK、S+、F+和SF组根系菌属的数量分别为746、590、678和715个.其中，4组共有菌属数为472个，占总属数的19.92%.Candidatus、Saccharimonas、异球藻属(Xenococcus)和棒杆菌属(Corynebacterium)等58个属只存在于CK组；S+组特有菌属为韦荣氏球菌属(Veillonella)、Methylocapsa、Ottowia和Methanoregula；F+组含有黄杆菌属(Thermomonas)、Batrachochytrium和共球藻属(Trebouxia)等87个特有菌属；Mucinivorans、离蠕孢属(Bipolaris)和炭团菌属(Annulohypoxylon)等42个属仅存在于SF组.与CK组相比，S+和F+组分别有35和130个特有菌属(CK组分别有191和198个特有菌属)，说明接种S.indica和FocTR4均会导致根系原有的特有菌属数量下降；与S+组相比，SF组特有菌属为172个(S+组为47个)，说明S+组经FocTR4处理后根系特有菌属数量明显增加.

CK:接种PDB溶液;S+:接种S.indica悬浮液;F+:接种FocTR4悬浮液;SF:接种S.indica和FocTR4悬浮液.

3 讨论

3.1 接种S.indica和FocTR4均会降低香蕉根系微生物多样性

本研究发现，3个处理组的物种种数和Shannon指数均低于CK组，表明接种S.indica和FocTR4均会降低香蕉根系微生物多样性.这可能是由于S.indica和FocTR4与根系原有微生物相互竞争，促进了特定相关菌类的生长，抑制了其他菌类的生长发育，并破坏了原有的稳定结构[25-26].

根系微生物群落结构复杂，其能根据外界环境的改变而产生适应性调整，并且这种调整主要体现在优势菌群变化方面[27-28].本研究通过分析香蕉根系微生物物种组成和相对丰度发现,在门分类水平上，变形菌门、放线菌门和厚壁菌门为各组优势菌的主要类群，但接种S.indica和FocTR4会改变其占比.与对照相比，S.indica和FocTR4能分别增加厚壁菌门和放线菌门的占比，同时接种两者能提高变形菌门的丰度.在属分类水平上，共有25个优势菌属，形成5个分支，不同程度地聚集在每组样本内.其中，葡萄球菌属主要在S+组富集，F+组中链霉菌属占比最高，根瘤菌属则是SF组的最优势菌属.此外，接种S.indica和FocTR4会导致根系菌群结构发生改变.S.indica处理后香蕉根系中厚壁菌门和变形菌门以及葡萄球菌属的相对丰度显著提高，这与球囊霉属的丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)能增加水稻根际土壤中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)数量，提高土壤细菌丰富度的报道[29]类似.

3.2 FocTR4侵染会诱导香蕉根系放线菌门的富集

大多数植物体内都存在丰富的内生微生物，其中，放线菌门是主要组成部分.内生放线菌通过产生大量天然生物活性产物，促进植物生长发育，抵制病原菌入侵，提高植株的抗性[30].感染菌核病菌的大豆根系内放线菌的多样性优于健康植株[31]；抑制性土壤(含有大量拮抗微生物的资源地)中放线菌门丰度显著高于非抑制性土壤[32-33].本研究中，F+组的放线菌门占比最高，表明FocTR4入侵会激发香蕉根系防御反应，诱导内生放线菌门菌株的富集.研究发现，健康和抑制性的香蕉土壤中链霉菌属、根瘤菌属和芽孢杆菌属的相对丰度较高[34-35].其中，链霉菌能产生具有抗菌活性的代谢产物，对多种病原菌表现出抑制效果.蕉园土壤中分离的链霉菌YYS-7和CB-75以及香蕉根系分离的链霉菌S96均能显著抑制FocTR4的生长[36-38].本研究中，F+组中链霉菌属的占比最高.链霉菌属菌株可能通过多种机制参与香蕉枯萎病菌的早期防御反应，包括竞争底物、分泌抗生素和分解酶等，从而协助根系抵御FocTR4的入侵[39].

3.3 S.indica可能通过影响根系根瘤菌丰度提高香蕉对枯萎病的抗性

有研究指出，AMF定殖能增加豆类植物的根瘤数量，而接种根瘤菌会降低AMF的定殖率，两者共同作用可以抑制大豆红冠腐病的发生[40-41].Wang et al[42]研究发现,菌根共生缺陷体苜蓿的根际微生物群落中根瘤菌的数量显著下降.Sharma et al[43]发现，S.indica和根瘤菌相互作用能提高大麦幼苗对白粉病的抗性.本研究发现：接种FocTR4 2个月后，F+组的香蕉苗叶片黄化枯萎，枯萎病症状明显，而SF组则未出现明显症状，表明S.indica定殖可以延缓枯萎病症状的显现；同时，变形菌门和根瘤菌属在SF组中占比分别高达86.68%和58.91%，远超其他菌门和菌属在该组的占比.这暗示S.indica可能通过提高根瘤菌属的丰度增强香蕉对FocTR4的抗性.

4 结论

本研究通过宏基因组测序技术研究了S.indica和FocTR4对香蕉根系微生物群落结构的影响，结果发现它们均会影响根系微生物群落结构和多样性，并能提高香蕉根系中变形菌门、放线菌门或厚壁菌门的相对丰度.此外，本研究发现，链霉菌属和根瘤菌属分别显著富集于F+和SF组，推测这两种菌属菌株可能在香蕉根系抵御FocTR4入侵和诱导香蕉对枯萎病抗性过程中发挥重要作用.今后可以通过研究这些菌株对香蕉枯萎病发生率和发病情况的影响进一步揭示其功能.