蓝尾蝾螈皮肤转录组及活性多肽分析

唐 兴, 王洪亮, 梁广男, 刘雅莉, 段志贵

(1.衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008；2.衡阳师范学院南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421008；3.东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室，江西 南昌 330013；4.湖南师范大学动物多肽药物国家地方联合工程实验室，湖南 长沙 410081)

为了保护自己免受掠食者侵害，两栖动物已进化出不同的形态、生理和行为特征[1].两栖动物皮肤分泌物含有大量的活性多肽.这些多肽储存在两栖动物皮肤的颗粒腺体中，在受到压力或受伤时可以高浓度释放到皮肤分泌物中[2]，它们能保护皮肤免受环境和致病性的伤害，并发挥许多其他生物学作用[3].

大量的研究证明，两栖动物皮肤活性多肽具有潜在药物治疗作用.在过去的几十年里，蛙和蟾蜍(两栖类无尾目)皮肤分泌物中的生物活性多肽被广泛研究，目前已发现约2 000个(超过100个家族)活性多肽[2-6].这些皮肤活性多肽功能各异，包括抗菌肽、神经肽、缓激肽、蛙皮素、速激肽、色氨肽、胆囊收缩素、阿片样肽、蛋白酶抑制剂肽、抗氧化肽、凝集素、胰岛素释放肽、肥大细胞降解/组胺释放肽、伤口愈合肽，免疫调节肽、神经元一氧化氮合酶抑制剂等[2].但是，蝾螈(两栖类有尾目)的皮肤活性多肽鲜有报道[7-9].

蓝尾蝾螈(Cynopscyanurus)属于两栖纲、有尾目、蝾螈科、蝾螈属，分布于我国贵州和云南的海拔1800米以上地区，多栖息于水塘、稻田水沟、沼泽地水坑，其捕食对象包括蚊、蝇虫等有害昆虫的幼虫[10,11]，因此蓝尾蝾螈是一种具有重要的农业保护价值的两栖动物.目前关于蓝尾蝾螈的发育、繁殖生态、肢体再生等研究已有一些论文报道[10-12]，但是未有对其皮肤的物质组成和功能进行研究报道.本研究首次对蓝尾蝾螈皮肤进行转录组测序，并分析其转录组和活性多肽成分.

1 材料与方法

1.1 蓝尾蝾螈皮肤总RNA提取和检测

将锡箔纸包裹铁制器具和研钵后在180 ℃下烘烤过夜以灭活RNA酶.双蒸水及滤纸均灭菌处理.试验所用枪头、离心管、手套等均为RNase Free产品.用70%乙醇擦洗超净台后，将所有试验用品在紫外灯下照射1 h.

蓝尾蝾螈成体(图1)购买于云南某养殖场，为人工繁殖的后代.取蓝尾蝾螈成体1只，用双蒸水清洗皮肤后用滤纸擦干.用眼科剪剪破蓝尾蝾螈背部皮肤，再用镊子撕下皮肤后立刻加入到液氮预冷的研钵中研磨约10 min至粉状，再通过Trizol试剂盒提取蓝尾蝾螈皮肤总RNA.

图1 蓝尾蝾螈

取适量皮肤总RNA以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳以鉴定RNA样品浓度、纯度、完整性.RNA样品达到以下要求即可符合cDNA文库构建要求：RNA总量≥10 μg；RNA浓度≥200 ng·μL-1；RNA完整值≥7.0，28S∶18S浓度比≥1.0.

1.2 cDNA文库的构建及测序

总RNA用DNaseⅠ处理后，采用Oligo(dt)—磁珠法分离mRNA.在mRNA中加入片段化试剂以形成mRNA短片段，并以其为模板合成第一条链cDNA，然后以双链合成反应体系合成双链cDNA.将双链cDNA纯化后加入EB缓冲液，再进行末端修复.双链cDNA的3′末端添加腺嘌呤(A)并连接接头，再选择合适片段大小的双链cDNA进行PCR扩增.cDNA文库质检合格后使用Illumina HiSeq 4000进行测序.

1.3 测序数据处理和生物信息学分析

测序获得的原始reads经过过滤后，获得clean reads数据.使用Trinity软件对clean reads重叠序列连成更长的片段contig(重叠群),然后使用Tgicl软件将来自同一转录本的不同contig进行聚类、去冗余、组装，得到最长的unigene序列.

通过Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对所有unigene进行NT、NR、COG、KEGG、SwissProt注释，使用Blast2GO(www.blast2go.com)以及NR注释结果进行GO注释，采用 InterProScan5[13]进行InterPro注释.根据unigene的COG和GO注释结果，统计了各自的功能分类.

多肽前体序列使用信号肽在线软件SignalP-5.0 Server[14]识别多肽信号肽序列，再利用MEGA 6.0软件将皮肤活性多肽与其同源多肽的氨基酸序列进行对比.

2 结果与分析

2.1 蓝尾蝾螈皮肤总RNA质检数据

在本试验中，蓝尾蝾螈皮肤总RNA经过质检后，其浓度为684 ng·μL-1，RNA总量为13.68 μg，RIN为7.6，rRNA的28S∶18S浓度比为1.2.蓝尾蝾螈皮肤总RNA完全满足cDNA文库构建要求.

2.2 测序数据结果

本试验使用Illumina HiSeq 4000共测定了6.65 Gb数据.测序的原始reads总数目为47.36 M，而过滤后clean reads数目为44.35 M(占原始reads总数93.64%).然后clean reads组装成contig，再通过聚类去冗余和组装得到75 462个unigene，其N50、GC含量、平均长度、总长度分别为1 617 bp、45.64 %、818 bp、61 801 999 bp.

2.3 功能注释

所有unigene在NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot、Interpro数据库中完成注释后，统计了注释结果(表1).其中NR、Swissprot、KEGG数据库的注释unigene最多，均占unigene总数的30%以上(分别为42.31%、35.50%、32.74%).所有注释的unigene去冗余后，共获得34 850个非冗余注释unigene，占unigene总数的46.18%.

表1 蓝尾蝾螈皮肤转录组unigene的功能注释统计

Unigene注释结果的物种分布如图2所示，注释结果为两栖类物种的unigene数目约占注释总数的16%；注释结果最多的两栖类物种是热带爪蟾(Xenopustropicalis)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)，注释结果分别约占注释总数的11%和4%；注释结果为其他两栖动物约占注释总数的1%，其中一些注释结果来源于蝾螈物种，如墨西哥钝口螈、红腹蝾螈、绿红东美螈、东方蝾螈等.

图2 蓝尾蝾螈皮肤转录组unigene注释结果的物种分布

将COG数据库的注释基因进行功能分类(图3).共鉴定22 154个COG注释项(25个COG类别).其中，“一般功能基因”(3 802个，占比为17.16%(3 802/22 154),下文同)的COG注释项最多；其次是“翻译、核糖体结构与生物发生”(2 180个，占比为9.84%)、“复制、重组和修复”(2 086个，占比为9.42%)、“转录”(1 745个，占比为7.88%)、“细胞周期控制、细胞分裂、染色体分裂”(1 390个，占比为6.27%)、“翻译后修饰、蛋白质周换、分子伴侣”(1 309个，占比为5.91%)、“未知功能基因”(1 309个，占比为5.91%)；而COG注释项最少的类别是“核结构”(7个，占比为0.03%)以及“胞外结构”(39个，占比为0.18%).

1.翻译、核糖体结构和生物发生；2.转录；3.信号转导机制；4.次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢；5.RNA处理和修饰；6.复制、重组和修复；7.翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣；8.核苷酸转运和代谢；9.核结构；10.脂质运输和代谢；11.细胞内运输、分泌和囊泡运输；12.无机离子转运和代谢；13.一般功能蛋白；14.未知功能蛋白；15.胞外结构；16.能量生产和转换；17.防御机制；18.细胞骨架；19.辅酶转运和代谢；20.染色质结构和动力学；21.细胞壁/膜/包膜生物发生；22.细胞运动；23.细胞周期控制、细胞分裂、染色体分裂；24.糖类运输和代谢；25.氨基酸转运与代谢.

通过基因本体论(gene ontology, GO)数据库对所有unigene进行功能分类(图4)，共获得76 963个GO注释项.其中，涉及生物过程的GO注释项有38 192个(49.62%)，涉及细胞成分的GO注释项有27 409个(35.61%)，涉及分子功能的GO注释项有11 362个(14.76%).

1.行为；2.生物粘附；3.生物相；4.生物调节；5.细胞聚集；6.细胞杀伤；7.细胞成分组织或生物发生；8.细胞过程；9.发育过程；10.生长；11.激素分泌；12.免疫系统过程；13.定位；14.运动；15.代谢过程；16.多细胞生物过程；17.多生物过程；18.生物过程的负调控；19.生物过程的正向调节；20.生物过程的调节；21.刺激反应；22.节律过程；23.信号传递；24.单组织过程；25.细胞；26.细胞连接；27.细胞组分；28.胶原三聚体；29.细胞外基质；30.细胞外基质组分；31.细胞外区域；32.细胞外区域组分；33.大分子复合物；34.膜；35.膜包腔；36.膜组分；37.细胞器；38.细胞器组分；39.突触；40.突触组分；41.抗氧化活性；42.结合；43.催化活性；44.通道调节活性；45.趋化活性；46.化学排斥活性；47.电子载体活性；48.酶调节活性；49.鸟苷酸交换因子活性；50.金属伴侣活性；51.分子转换器活性；52.核酸结合转录因子活性；53.蛋白质结合转录因子活性；54.蛋白质标签；55.受体活性；56.受体调节活性；57.结构分子活性；58.翻译调节活性；59.转运体活性.

2.4 蓝尾蝾螈皮肤活性多肽

在蓝尾蝾螈皮肤转录组学中鉴定到多种皮肤活性多肽.其中，胆囊收缩素、速激肽、防御素、降钙素、蛋白激酶抑制剂与已知多肽序列进行比较，结果发现在其他物种中均存在相同的成熟肽序列(表2).

表2 其他物种中存在相同成熟肽序列的蓝尾蝾螈皮肤活性多肽

另外，本次试验还鉴定一些与已知多肽具有高同源性的活性多肽，包括神经肽FF和神经肽AF、胸腺肽β4、C型利钠肽、降钙素基因相关肽、cathelicidin类抗菌肽等，它们与已知多肽序列具有高度的序列相似性.下面将对这些高同源性的活性多肽进行详细分析.

2.4.1 神经肽FF和神经肽AF 神经肽FF和神经肽AF最初被认为是一种抗阿片肽[15]，能介导疼痛反应.后来的研究证明神经肽FF还具有一些其他作用，如调节神经内分泌系统、能量平衡、抗炎、疼痛传递和脂肪组织巨噬细胞的外周调节[16].而神经肽AF主要研究聚焦于动物摄食[17-19]和记忆[20].

本研究鉴定的蓝尾蝾螈神经肽FF与来源于加蓬蚓螈(Geotrypetesseraphini)以及非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的神经肽FF具有较高的序列相似性，仅N端氨基酸有差异(表3).蓝尾蝾螈神经肽AF与3种两栖类动物—非洲爪蟾、热带爪蟾(Xenopustropicalis)、美洲牛蛙(Lithobatescatesbeianus)的神经肽AF的序列相似性超过83%(表4).从表3和表4可以看出，神经肽FF家族和神经肽AF家族的成熟肽C端序列均高度保守，且C末端均具有酰胺化的苯丙氨酸(F)残基.

表3 神经肽FF的成熟肽序列1)

表4 神经肽AF的成熟肽序列1)

2.4.2胸腺肽β4 胸腺肽β4是一种天然再生蛋白，具有血管生成和抗炎活性，并可在伤口处聚集大量血小板，在组织保护、修复和再生中起着重要作用[21-23].本次试验鉴定的蓝尾蝾螈胸腺素β4与两种蚓螈—加蓬蚓螈和Microcaecilia属蚓螈(Microcaeciliaunicolor)的胸腺素β4具有较高的序列相似性.它们均富含碱性氨基酸K以及酸性氨基酸E，而且它们的N端氨基酸序列在进化上相对保守(表5).

表5 胸腺肽β4的成熟肽序列1)

2.4.3 C型利钠肽 C型利钠肽不仅调节血管张力和血压，而且还调节多种心血管效应[24].此外，研究结果也表明C型利钠肽也参与了四肢骨骼发育的调节[25].将蓝尾蝾螈C型利钠肽前体与美洲牛蛙C型利钠肽前体进行序列比较，结果发现它们在信号肽(signal peptide)和中间肽(propeptide)的序列相似性很低.它们的成熟肽序列含有一对二硫键，且序列相似性达到86%(表6).

表6 C型利钠肽前体序列1)

2.4.4 降钙素基因相关肽 降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是一种高效血管舒张剂，对多种心血管疾病具有保护作用[26].此外，降钙素基因相关肽的表达水平与躯体、内脏、神经病理性和炎症性疼痛之间存在一定相关性[27].

将蓝尾蝾螈CGRP前体与高山倭蛙(Nanoranaparkeri)CGRP前体进行序列比较，结果发现它们均存在成熟肽将两段中间肽(中间肽1和中间肽2)隔开的序列结构，而且成熟肽序列高度相似(表7).两种两栖动物的CGRP前体的N端序列在进化上比C端更保守，且C末端均具有酰胺化的苯丙氨酸(F)残基.

表7 降钙素基因相关肽前体序列1)

2.4.5 cathelicidin类抗菌肽 在脊椎动物中均存在具有广谱抗菌活性的cathelicidin类抗菌肽[28].从红瘰疣螈皮肤中鉴定到一种cathelicidin，该多肽有助于蝾螈伤口愈合和皮肤再生.由于红瘰疣螈cathelicidin仅含有12个氨基酸残基，因此具有开发成为新型创伤愈合剂的潜力[29].

在分类学上，蓝尾蝾螈属于蝾螈科蝾螈属，而红瘰疣螈属于蝾螈科疣螈属.将两种蝾螈的cathelicidin前体序列进行比较(表8)，结果发现它们信号肽的序列相似性最高(95.0%)，中间肽的序列相似性略低(83%)；而成熟肽序列中均含有一对二硫键，但是两者相似性最低(47%).由于两种成熟肽相似性较低，因此下一步将深入比较研究两种蝾螈cathelicidin的抗菌或伤口愈合活性.

表8 cathelicidin前体序列1)

3 讨论与结论

两栖动物的皮肤直接暴露于不同的环境中，其环境因素包括微生物、寄生虫、捕食者、物理、化学因素等，它的特殊栖息地也是作为水陆进化之间的桥梁[2].因此，研究两栖动物皮肤成分对阐明其生理学功能具有重要科学意义.

本研究首次揭示了蓝尾蝾螈皮肤转录组和活性多肽成分.通过生物信息学分析，共获得75 462个unigene.在功能数据库注释后得到34 850个非冗余注释unigene，占unigene总数的46.18%，其中注释结果为两栖类物种的unigene数目约占注释总数的16%.分别对GO和COG数据库的注释unigene进行功能分类.另外，从蓝尾蝾螈皮肤转录组中鉴定到多种皮肤活性多肽，如胆囊收缩素、速激肽、防御素、降钙素、蛋白激酶抑制剂、神经肽FF和神经肽AF、胸腺肽β4、C型利钠肽、降钙素基因相关肽、cathelicidin类抗菌肽等.下一步将合成或表达这些皮肤活性多肽并进行详细的功能研究.