基于高通量转录组测序技术研究钩吻对猪肾脏的影响

黄思娟, 黄崇银, 曹俊杰, 王 永, 刘兆颖

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省兽药工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)

钩吻[Gelsemiumelegans(Gardn.& Champ.)Benth.]为马钱科胡蔓藤属植物，分布于我国广西、福建、浙江等地[1].钩吻一直作为我国传统的中草药被世人所知，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎镇痛、促生长等多种药理作用[2].但钩吻毒性极强，毒性剂量与有效治疗剂量相接近，误食后极易引起中毒，故一般以外用为主.钩吻中毒后，临床表现以消化系统、呼吸系统和神经系统症状为主[3-4].尽管钩吻毒性极大，但有记载表明，食用钩吻对羊、猪等动物具有促生长功效[5-6].

近年来，从钩吻中提取出了200多种生物碱，其中，钩吻素子和钩吻素甲为其主要活性成分[7].钩吻素子在机体内迅速、广泛分布，大鼠静脉注射后，可以在各个组织中被检测到，其中在肾脏中有较高的药物浓度，肾脏排泄或许是其主要的排泄途经[8].魏文增等[9]对钩吻素子在人和多种试验动物的肝微粒体体外代谢的差异进行比较，结果表明，在人体中的相对降解量最低，仅代谢22.28%.钩吻生物碱在人体内缓慢消除，其代谢产物和代谢率等也不同，这或许是钩吻对人体产生毒性反应的原因之一[10].肾脏是机体内重要的代谢和排泄组织，对于研究药物的代谢以及药物之间的相互作用具有重要意义，但有关服用钩吻后对肾脏代谢和物质转运影响的研究很少.因此，本研究采用高通量测序技术对猪肾脏进行转录组测序，旨在探究钩吻对猪肾脏代谢与转运的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 选购湖南新五丰永安分公司的健康雄性去势二元杂种(长白猪×大白猪)断奶仔猪(60日龄左右)，体重(20±2)kg，共10头.

1.1.2 主要试剂 Trizol试剂盒(TruSeq RNA LT Sample Prep Kit v2)、测序试剂1(TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS)、测序试剂2[TruSeq SBS Kit v3-HS(200-cycles)]均为美国Illumina公司产品；捕获磁珠(AmpureBeads)、磁珠(AmpureBeads)均为美国Beckman公司产品；Qubit定量试剂盒(Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)为美国Life公司产品.

1.1.3 主要仪器 Hiseq 2000高通量测序仪、CBOT簇生成仪均为美国Illumina公司产品；冷冻离心机为美国Scan Speed公司产品；分光光度计、浓缩仪、常温离心机均为美国Thermo公司产品；Qubit为美国Invitrogen公司产品；电泳仪、凝胶成像系统均为中国天能公司产品；超声波破碎仪为比利时Biorupter公司产品；漩涡混合仪(vortex-genie2)为美国SI公司产品；摇床、磁力架均为中国智城公司产品；移液器为德国Eppendrof公司产品；普通PCR仪为美国Life公司产品.

1.2 方法

1.2.1 样品采集 将10头仔猪随机分为对照组和给药组两组.对照组饲喂不含抗菌药物的全价日粮(日粮购自湖南新五丰永安分公司)，给药组饲喂不含抗菌药物的全价日粮+2%钩吻全草粉末(全草粉末购自福建省)，每组5头，单栏饲养.连续饲养45 d后停止给药，所有仔猪禁食24 h，于停药1 d后，在遵循动物福利剖解程序的情况下放血处死，继而解剖，快速采集各组仔猪的肾组织，置入蒸馏水中清洗后放入冻存管，用封口膜封好，并迅速置于液氮中速冻，再转入冰箱(-80 ℃)中冷冻保存，每组随机挑选3份组织样本进行高通量转录组测序.

1.2.2 总RNA提取与质量检测 用Trizol法提取肾脏组织总RNA；用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性(28S∶18S≥1.5)，用分光光度计检测RNA纯度(D260 nm∶D280 nm为1.8～2.2)，用Qubit 2.0精确定量RNA浓度.在RNA提取前，对操作过程中用到的所有器械进行去RNA酶处理.

1.2.3 测序文库的构建 总RNA样品检测合格后，进行文库构建.首先用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，随后将富集到的mRNA随机打断成200 bp左右的短片段.以短片段mRNA为模板，用随机引物反转录合成一链cDNA，合成双链cDNA时，dNTPs中的dTTP被dUTP代替.再用核酸纯化磁珠纯化双链cDNA，然后进行末端修复，并加A尾和测序接头.最后用USER酶消化双链cDNA，使其文库只含一链cDNA，PCR扩增15个循环得到最终的cDNA文库.

1.2.4 测序、数据处理 采用Illumina测序平台的双端测序模式对样本进行高通量测序.根据Illumina测序数据的低质量分数集中于末端的分布特点，运用Trim Galore软件对测序数据从3′端动态去除并接头序列片段和低质量片段, 再用FastQC软件对预处理数据进行质量控制分析以及统计Q20和Q30的碱基比例；然后将修剪后的序列读数片段进行质量评估，并统计序列读数片段的长度分布和GC百分比；最后利用STAR软件将预处理序列与测序物种的参考基因组序列(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/sus_scrofa/dna/)进行序列比对.

1.2.5 差异表达基因分析 采用每百万条片段中能匹配到某基因1 000 bp长的外显子区域的片段数目(FPKM)计算度量指标计算给药组和对照组样本的基因表达量，再用DESeq2软件对两组样本比较筛选差异表达基因，以|log2差异倍数|≥1、错误发现率≤0.05为筛选条件找出显著差异表达的基因，并对其做基因本体论(gene ontology, GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)注释及通路富集分析.

1.2.6 荧光定量PCR验证 根据转录组学数据，设计5对引物(表1)，引物有含黄素单氧化酶2(flavin containing monooxygenase 2,FMO2)、金属硫蛋白-3(Metallothionein-3,MT3)、溶质载体家族2成员13(solute carrier family 2 member 13,SLC2A13)、醛氧化酶1(aldehyde oxidase,AOX1)、溶质载体家族35成员5(solute carrier family 35 member A5,SLC35A5)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH).提取给药组和对照组的总RNA，经完整性检验合格之后，反转录成cDNA，然后进行荧光定量PCR检验.每个样品设置3组重复，采用2ΔΔCt法计算相关基因mRNA的转录水平[11].

表1 荧光定量PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 测序数据统计结果

对照组和给药组共6组样本测序后得到的原始序列读数片段平均为51 343 311条，修剪后的序列读数片段平均达到50 394 236条.其中，每个样本中过滤后的Q20碱基比率在97%以上，Q30碱基比率在92%以上，唯一比对上参考基因的序列读数片段数超过40 442 834条(表2)，说明测序数据质控良好，转录组测序结果真实可靠.

表2 原始质控数据统计

2.2 基因表达量统计结果

FPKM为基因表达量.将对照组和给药组差异表达基因的FPKM进行统计,结果如表3所示.在肾脏组织中，高表达的基因数(FPKM>50)基本在400左右，而不表达或者是低表达的基因数(FPKM<1)在8 200以上.

表3 全部样本不同FPKM区间分布的基因数1)

2.3 差异基因表达结果

针对有重复样本的试验设计利用DESeq2软件在不同样本组之间筛选差异表达的已知基因，满足|log2差异倍数|≥1、错误发现率≤0.05的筛选条件筛选两组之间的差异基因.筛选结果显示，一共有301个差异表达显著基因，其中有180个基因下调，121个基因上调.对差异表达显著的基因进行筛选，发现其中与代谢、转运相关的基因表达量显著降低，如SLC35A5、SLC2A13、FMO2、AOX1等(表4).

表4 与代谢或转运相关基因表达量的变化(部分)

2.4 差异表达基因GO功能富集结果

利用GO数据库对差异表达基因分为生物学过程、分子功能和细胞组分3个方面进行注释.结果(图1)显示：生物学过程主要富集在对病毒的防御反应、对外部生物刺激的反应、氧气代谢过程、病毒过程的负调节、病毒生命周期的负调节等；分子功能主要富集在过渡金属离子结合、无机阴离子交换活性等；细胞组分主要富集在膜固有成分、膜部分、神经元细胞体、膜的组成部分等.

图1 差异表达基因GO功能富集结果

2.5 差异表达基因KEGG功能富集结果

图2显示，差异表达基因显著富集的通路主要为以下7条：属于免疫系统的RIG-I-like受体信号通路和IL-17信号通路，属于内分泌系统的松弛素信号通路，属于感染性疾病的麻疹和甲型流感，属于辅因子和维生素代谢的视黄醇代谢，属于物质依赖的酒精中毒.

图2 差异表达基因KEGG通路富集结果

给药组和对照组差异表达基因经GO功能富集分析发现，与肾脏代谢、转运相关的基因FMO2、SLC2A13、AOX1、SLC35A5表达量均下调，或许是钩吻影响肾脏的物质转运和药物代谢，继而采用荧光定量PCR验证这些差异表达基因.结果(图3)显示，基因表达水平的趋势与转录组学分析得到的结果(表5)基本一致.

***表示P=0.000 1.

表5 5个与肾脏代谢、转运相关的基因的转录组数据

3 讨论

有研究报道，CYP3A是钩吻生物碱的主要代谢酶，介导了钩吻生物碱在体内的多种代谢途径[11].体外研究结果表明，钩吻生物碱可以抑制CYP450多个亚型的活性[12].在本研究中，与代谢相关的基因，如FMO2、AOX1的表达量也显著下调.这两个基因都富集在药物代谢—细胞色素P450通路上，FMO2是通过以NADP+、FAD为辅酶和辅基实现异种物质代谢，在含氮和含硫的内源性底物的代谢过程中扮演着重要角色，可促进底物氧化，加快底物代谢[13].AOX1则能催化多种药物和内源性化合物的氧化[14]，与细胞代谢过程、前体代谢物及能量的产生、代谢等相关.与体外研究结果[12]一致的是，本研究结果也表明长期饲喂钩吻或许抑制肾脏代谢酶的活性.

药物转运体是一种膜蛋白，主要负责机体内药物的吸收、转运和排泄等过程.大量研究表明，药物转运体表达量的下降[15]会影响药物的吸收，从而减弱药物的治疗效果，并且当转运体的活性被抑制时，药物的摄取和代谢也将会受到影响，这也是许多药物之间产生相互作用的重要原因之一[16].本研究结果表明，与物质转运有关的基因，如SLC2A13、SLC35A5的表达量显著下调.SLC2A13属于溶质载体家族2(SLC2A)，功能主要与转运体活性或者转运蛋白活性有关.另外，SLC2A13基因编码一种H+/肌醇共转运体HMIT，在肌醇的代谢中起到关键作用[17].SLC35A5属于溶质载体家族35，相关研究较少，目前看来，SLC35A5蛋白或是一种高尔基体多蛋白复合物，参与核苷酸糖转运[18].肾脏转运体表达量的下降，影响了内源性物质的吸收，糖类等物质摄取减少，同时可能会对内分泌系统产生影响，松弛素信号通路被激活；另一方面，转运体的表达减少，物质运输受到抑制，减少药物的排泄，可能会导致毒性.

本研究利用转录组测序技术研究钩吻对猪肾脏代谢与转运的影响.通过对基因GO功能富集分析发现，与代谢、转运相关的基因出现显著下调，如SLC25A5、SLC2A13、FMO2、AOX1等，由此推测饲喂钩吻对仔猪肾脏的物质转运和药物代谢有一定的影响.