羽毛降解菌Deinococcus actinosclerus RM的分离、鉴定及其产生的蛋白酶酶学性质

柯 野, 谢天涵, 梅颖诗, 张 敏, 黄 湘, 屈奇奇

(韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005)

随着现代养殖畜牧业的迅速发展，其带来的不仅是环境污染问题，同时伴随着许多废弃物的产生，这些废弃物的无害处理以及回收利用越来越受到人们的关注，如家禽屠宰后的毛发处理就是一个需待解决的问题.羽毛本身是一种丰富的蛋白质资源[1]，但其利用率低，在生产实践上通常采用焚烧、填埋或高温降解等方式进行简单处理，这些方式不仅不能充分利用羽毛中的丰富蛋白质资源，同时造成的环境问题令人堪忧[2].动物毛发，尤其是家禽羽毛，富含蛋白质高达80%，其中大部分由角蛋白质组成[3].角蛋白不溶于水，有较好的结构稳定性[4]，导致不易被降解，因此，羽毛蛋白质资源的难以利用是现今需待解决的问题.目前越来越多的研究开始探索对羽毛废弃物的高价值利用，在对羽毛开发利用的各种方法中，生物酶法是最安全、经济、对环境无污染的方法，但生物酶法存在处理周期长、酶稳定性差、降解效率低等问题，这些问题是对解决羽毛高值化利用的关键所在.就提高生物酶对羽毛的高效降解，首先，应筛选获得对羽毛降解效率高的酶，但目前市场上对羽毛降解的酶效率不高，因此，从微生物中筛选出能分泌大量高效降解羽毛的降解酶的微生物，是一种解决羽毛降解的最佳途径之一[5].

目前已从自然界筛选获得了细菌、放线菌和霉菌，共计30多种对羽毛具有降解作用的微生物；在这些微生物中，霉菌虽然能产生角蛋白酶，但这些角蛋白酶具有一定的致病性，因此，较多研究者主要专注于细菌和放线菌产生的角蛋白酶.但对于目前获得的羽毛降解菌而言，大多数菌株对羽毛降解效率低，投入到实际生产应用还有较大的差距.本研究旨在寻找高效降解羽毛的菌株，研究其产生的蛋白酶酶学性质，使其为羽毛的高效降解和高值化开发利用提供一定的技术参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 羽毛降解菌分离于羽毛废弃物的排水沟污泥中.

1.1.2 培养基 羽毛粉固体培养基含1.5 g·L-1K2HPO4、0.025 g·L-1MgSO4·7H2O、0.015 g·L-1FeSO4、0.025 g·L-1无水CaCl2、10.0 g·L-1羽毛粉、20.0 g·L-1琼脂、1 L蒸馏水，pH自然.

富集培养基含0.1 g·L-1MgCl2·7H2O、0.5 g·L-1NaCl、0.4 g·L-1KH2PO4、0.5 g·L-1NH4Cl、0.3 g·L-1K2HPO4、1.0 g·L-1酵母提取物、10.0 g·L-1羽毛粉、少许完整的羽毛，pH自然.

羽毛发酵培养基的各种成分与羽毛粉固体培养基相同，仅用50.0 g·L-1羽毛代替羽毛粉，无琼脂.

1.1.3 试剂 甘氨酸、酪氨酸、谷氨酸购自上海展云化工有限公司；高效薄层层析硅胶板HSGF254(5×10)购自烟台江支硅胶开发有限公司；缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸购自广州普博欣生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯.

1.2 菌株的分离筛选

1.2.1 菌株的富集、分离和纯化 将采集的污泥样品，接种少许于富集培养基中，于28℃、160 r·min-1培养3 d；将适量富集液涂布在羽毛粉固体培养基平板上，培养5～7 d后挑取长势良好的菌株，通过多次划线分离，直至获得纯化的菌株，保存备用.

1.2.2 菌株的发酵筛选 将各个菌株分别接种于LB液体培养基(50 mL·瓶-1)中，于28 ℃、160 r·min-1活化2 d后接种至发酵培养基中，于28 ℃、160 r·min-1培养7 d；用滤纸过滤，称量烘干至恒重的残余羽毛；采用失重法计算降解率，即羽毛降解率/%=[(发酵培养基中的羽毛干重-发酵后羽毛残渣干重)/发酵培养基中的羽毛干重]×100.

1.3 RM菌株的鉴定

1.3.1 RM菌株的形态特征 将羽毛降解效果最佳的RM菌株接种于LB平板上，于28 ℃培养2 d，观察菌落形态及显微结构.

1.3.2 RM菌株16S rDNA的分子鉴定 参照玻璃珠法[6]提取RM菌株的基因组，稍有改动：1.0 mL过夜培养的菌液于12 000 r·min-1离心2～3 min，弃上清后，菌体沉淀重悬于STES缓冲液中，加入酸洗玻璃珠和TE缓冲液，再加入酚·氯仿振荡4 min，于12 000 r·min-1离心5 min，收集上清加入2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的乙酸钠，于12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min后，弃上清，加入70%乙醇洗涤DNA沉淀，离心5 min后，去掉上清，待乙醇室温挥发完后用TE缓冲液溶解基因组DNA.将基因组DNA送往生工生物工程(上海)有限公司进行全基因组测序.根据测序结果，分析其16S rDNA序列，将该序列与GenBank数据库序列进行比对分析.

1.3.3 RM菌株生理生化特性的鉴定 对RM菌株进行多种生理生化试验，试验方法参照文献[7].

1.4 羽毛含量对降解效果影响的试验

分别配制不同羽毛含量(1%、2%、4%、6%、8%、10%)的发酵培养基，接种RM菌株菌悬液1 mL(接种量1%)，于28 ℃、160 r·min-1培养7 d，测定RM菌株对不同羽毛含量的降解效果.

1.5 发酵天数对降解效果影响的试验

将RM菌株按1.0%(V/V)的接种量接种至装有100 mL 4%羽毛含量的发酵培养基中，于28 ℃、160 r·min-1摇床培养，取不同培养时间段(3、4、5、6、7、8、9 d)的发酵液，测定羽毛的降解率.

1.6 羽毛降解液中氨基酸的层析

对培养8 d的发酵液进行过滤，滤液于11 000 r·min-1离心10 min，收集上清.上清于60 ℃恒温干燥浓缩后加入2.5倍的无水乙醇，于-20 ℃放置沉淀30 min，再于11 000 r·min-1离心10 min，收集上清，进行薄层色谱法层析试验.配制展开剂(正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2)，在商业硅胶板上进行薄层色谱法层析，用茚三酮显色观察氨基酸的层析结果.

1.7 发酵液中粗酶液性质的测定

1.7.1 粗酶液的制备及酶活性的测定 收集发酵培养7 d的发酵液，过滤收集滤液，滤液于11 000 r·min-1离心10 min去除沉淀，收集上清，即为粗酶液.向粗酶液中添加(NH4)2SO4，使其饱和度达到80%以上，于4 ℃过夜盐析后，再于11 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，收集沉淀，用蒸馏水溶解，于透析袋(4 ℃)透析获得粗酶液，置4 ℃冷藏保存备用.按Folin-酚法[8]测定粗酶液的酶活性.

1.7.2 最适反应温度和最适pH的确定 测定粗酶液在30～60 ℃不同反应温度的酶活性，以确定最适反应温度；测定粗酶液在不同反应pH为8.0～12.5的酶活性，以确定最适合反应的pH.

1.7.3 金属离子和抑制剂对酶活性的影响 向粗酶液中分别添加不同的金属离子(Mg2+、Ni2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+)和蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟、亮抑蛋白酶肽、乙二胺四乙酸)，于4 ℃处理24 h后，测定其残余的酶活性.以超纯水代替含有金属离子或抑制剂的粗酶液作为对照.

1.7.4 不同酶液对不同底物的降解效果 分别向含有1 U·mL-1木瓜蛋白酶、粗酶液的溶液中添加羽毛、猪毛、头发等不同的毛类底物(底物含量均为4.0%)，于37 ℃酶解2 d后，测定底物的降解率.

2 结果与分析

2.1 羽毛降解菌株的分离筛选结果

将污泥样品进行富集培养后，在羽毛粉平板上多次划线分离，共获得13株长势较好的菌株.对这13株菌株进行液体发酵后，比较其降解率，其中，RM菌株的降解率最高.因此，本研究选取RM菌株作为研究对象.

2.2 RM菌株的分类鉴定结果

2.2.1 RM菌株的形态特征 RM菌株在LB固体培养基上的形态如图1所示.由图1可见，RM菌株的单菌落呈圆形隆起，鲜红色，湿润透明，易被接种环挑起.RM菌株的显微结构如图2所示.由图2可见，RM菌呈短杆形状，革兰氏染色为阳性.

图1 RM菌株的菌落形态

2.2.2 RM菌株16S rDNA序列的比对结果 将RM菌株基因组测序结果提交至GenBank数据库(Accession：QYCQ00000000.1)，分析获得了RM菌株16S rDNA序列，将该序列在GenBank数据库中通过BLAST 2.12.0在线软件获得同源性高的16S rDNA序列.用分子进化遗传分析软件MEGA 5.10进行发育树构建，结果如图3所示.由图3可知，RM菌株与D.saudiensisstrain YIM F302(Accession：NR_153717.1)、D.arenaestrain SA1(Accession：NR_146665.1)、D.actinosclerusstrain BM2(Accession：NR_148665.1)、D.hibiscistrain THG-AG1.5(Accession：NR_159297.1)的同源性高，亲缘关系近.因此，初步可知RM菌株属于异常球菌属(Deinococcus).

图3 RM菌株系统发育树

2.2.3 RM菌株的生理生化特性 RM菌株一系列生理生化试验结果显示，RM菌株为革兰氏阳性菌，无运动性，为好氧微生物.在淀粉水解、接触酶、硫化氢、明胶水解、硝酸盐还原及呼吸、油脂水解、吐温-80水解的试验中均呈阳性；在氧化酶、脲酶、糖(葡萄糖、蔗糖)发酵的试验中均呈阴性.结合RM菌株的形态结构、分子鉴定结果和生理生化特性参考相关文献[9]初步鉴定RM菌株为D.actinosclerus.

2.3 羽毛含量对降解效果的影响

由表1可知：RM菌株对不同羽毛含量降解效率的差异显著，羽毛含量越低，降解效果越强；羽毛含量越高，降解效果不佳.该结果与相关报道的“当羽毛粉含量高于1.5%时，菌株产生的胞外蛋白酶被抑制，导致羽毛粉的降解效率下降”[10]相一致.因此，本研究结合发酵成本与降解效果，选择4.0%作为最适羽毛含量进行后续试验.

表1 羽毛含量对羽毛降解效果的影响

2.4 发酵天数对降解效果的影响

由表2可知，随着培养时间的延长，羽毛降解率不断升高，第7天后趋于稳定，高于60%.

2.5 羽毛降解液中氨基酸的层析结果

羽毛降解液中氨基酸的层析结果如图4所示.由图4可知，羽毛被降解后，水解产物含有半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甲硫氨、谷氨酸等多种氨基酸，该结果与林香信等[11]测定的羽毛氨基酸成分相一致.由此可知，羽毛已被RM菌株降解.

图4 羽毛降解液中氨基酸的薄层色谱法层析图

2.6 粗酶液的酶学性质

2.6.1 最适反应温度和最适pH 粗酶液的最适反应温度和最适pH分别见图5和图6.由图5可见：蛋白酶最适反应温度为45 ℃;当温度低于40 ℃或高于55 ℃，酶活性显著下降，达不到最适反应温度相对活性的80%，这表明反应温度对酶活性的影响极显著.由图6可见：随着反应液pH的升高，酶活性逐渐提高，最适pH为10.0; 当反应pH高于10.0时，酶活性下降，这表明酶活性受pH的影响显著，粗酶液中的蛋白酶以碱性蛋白酶为主.

图5 温度对粗酶液酶活性的影响

2.6.2 金属离子和抑制剂对酶活性的影响 不同金属离子和抑制剂对粗酶液酶活性的影响如表3所示.由表3可知，Mg2+、Cu2+对酶活性有轻微的促进作用，而Ca2+、Ni2+、Zn2+对酶活性有抑制作用，其中，Ni2+、Zn2+的抑制作用较为明显.抑制剂对酶活性均有一定程度的抑制性.其中，苯甲基磺酰氟对酶活性有非常显著的抑制性，相对酶活性仅剩下31.8%，这表明粗酶液的蛋白酶以丝氨酸蛋白酶为主；亮抑蛋白酶肽对酶活性的抑制效果不显著，这表明粗酶液可能有少量的半胱氨酸；而胃蛋白酶抑制剂的抑制效果稍明显，相对酶活性为79.87%，这表明粗酶液可能含有天冬氨酸蛋白酶.

表3 金属离子和抑制剂对粗酶液酶活性的影响

2.6.3 不同酶液对不同底物的降解效果 降解后的羽毛较多呈颗粒粘稠状，头发和猪毛多呈断裂状.由表4可知：相较于木瓜蛋白酶,粗酶液对羽毛、头发、猪毛的降解率均更高，表明粗酶液对于商业化的木瓜蛋白酶有更好的降解效果.

表4 不同酶液对不同底物的降解率

3 结论

目前已有利用微生物降解羽毛的相关报道，但绝大多数分离获得的微生物，在羽毛较低的含量下才有较高的降解率.如吴小伦[12]分离的羽毛降解菌株ZDM在含有2.0%羽毛粉中，培养3 d后达到最大降解率，仅为55.9%；王继勇等[13]分离的羽毛降解菌株在1%羽毛粉中，培养4 d后达到最大降解率，仅为71.3%.本研究分离的RM菌株，对4.0%羽毛粉有高达64.0%的降解率，这表明该菌株比目前报道的多数菌株都具有较强的应用潜力.对RM菌株进行形态特征观察，将其16S rDNA序列提交至GenBank数据库中进行同源性比对分析，进一步通过生理生化试验初步鉴定出RM菌株为D.actinosclerus.

Mg2+、Cu2+对RM菌株产生的蛋白酶活性有促进作用，而Ca2+、Ni2+、Zn2+、苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、亮抑蛋白酶肽对酶活性有抑制作用.由此可推测，金属离子可能对酶的空间结构、活性位点具有一定的影响，导致其活性发生改变.除此之外，苯甲基磺酰氟是常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂，对酶活性有显著的抑制性，同时粗酶液的最适反应温度为45 ℃，最适pH为10.0，因此可推测该菌株产生的酶可能属于丝氨酸蛋白酶.该酶与商业化的木瓜蛋白酶相比，对羽毛有更强的水解能力，羽毛水解产物中含有多种氨基酸.因此，该菌株以及所产生的胞外蛋白酶无论是在理论研究，还是应用前景方面，都有一定的研究价值，今后可从酶基因的克隆表达、酶学性质、结构与功能以及对羽毛的降解机理等方面进行更深入研究.