污泥粪大肠菌群酶底物法替代多管发酵法的可行性研究

包亮亮

(甘肃省地质矿产勘查开发局第三地质矿产勘查院，甘肃 兰州 730050)

污泥是污水处理构筑物的沉淀物，含有大量的微生物，其中的粪大肠菌群数的高低表明了底泥的污染程度，也反映了对人体健康危害性的大小。《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)明确规定了污泥中粪大肠菌群的排放标准、检测方法，以及控制标准[1]；《城市污水处理厂污泥检验方法》(CJ/T221-2005)为检测城镇污水处理厂污泥中粪大肠菌群提供了检测技术规范[2]。测定污泥中的粪大肠菌群至今仍采用多管发酵法和滤膜法，标准方法至今没有改进。我国虽然在2006年《生活饮用水标准检验方法》[3]中采用酶底物方法，但其推广速度慢，一直没有得到发展。直到2018年生态环境部发布HJ1001-2018《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法》后[4]，水质检测粪大肠菌群的酶底物法才得到推广和应用，但污泥中的粪大肠菌群检测工作还停留在多管发酵法、滤膜法阶段。目前，酶底物法已经在50多个发达国家得到广泛应用，美国90%以上的实验室使用酶底物法，因此对污泥粪大肠菌群酶底物法的推广以及可行性研究具有重要意义。

1 多管发酵法

1.1 方法原理

多管发酵法又称多管发酵二步法[5]。(参照水质粪大肠菌群多管发酵检测方法[6])将污泥稀释样品加入到乳糖蛋白胨培养基试管中，经 37 ℃ 初发酵富集培养，大肠菌群分解乳糖产酸产气，产气的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，再经 44.5 ℃ 复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制干扰菌的生长，最后产气的细菌确定为粪大肠菌群。

1.2 仪器和试剂

1)仪器。高压蒸汽灭菌器；电热恒温培养箱：37 ℃，44.5 ℃ 可调；天平；试管等。

2)试剂。乳糖蛋白胨培养液、EC 培养基、无菌水等。

1.3 样品的预处理和制备

称取污泥样品 10 g 于三角瓶，加 90 mL 灭菌生理盐水，混匀5～10 min，制成1∶10(质量分数，下同)均匀稀释液。按此方法依次制成1∶100、1∶1000等不同质量分数的混匀菌液，推荐多管发酵法稀释度范围为质量分数：10-2～10-8，选择3个连续稀释度的混匀样品进行检测。

1.4 检测流程

1)初发酵试验。在5个装有 5 mL 的三倍乳糖蛋白胨培养基试管中(内有导管)，加入 10 mL 混匀稀释的污泥菌液；于各装有 10 mL 的单倍乳糖蛋白胨培养液的5个试管中加入 1 mL 混匀稀释的污泥菌液；于剩余5个试管中加入 0.1 mL 混匀稀释的污泥菌液。均置于(37±0.5)℃条件下，培养 24 h 观察。发酵试管颜色变黄为产酸，玻璃倒管内有气泡为产气。产酸和产气的试管表明试验呈阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的也为阳性。

2)复发酵试验。将初发酵试验呈阳性或疑似阳性的培养物接种到有EC培养基的试管中。在(44.5±0.5)℃ 下培养 24 h 后观察，产气证实为粪大肠菌群阳性，即证实有粪大肠菌群存在。查阅HJ347.2-2018中的MPN表，用公式MPN值=MPN指数×(10 mL/接种量最大值)[7]，换算得出 1 g(mL)污泥中粪大肠菌群数。

2 酶底物法

2.1 方法原理

方法原理采用水质粪大肠菌群酶底物法[4]。在(44.5 ±0.5)℃下培养 24 h，大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶和大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶分解代谢。选择培养基中的色原底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解为黄色的邻硝基苯盼(ONP)肠杆菌科细菌，培养基呈现黄色反应。定量分析水中粪大肠菌群的最大可能数。

2.2 仪器和试剂

1)仪器。程控定量封口机，97孔定量盘，100 mL 无菌采样瓶，恒温培养箱，手提式压力蒸汽灭菌锅，稀释瓶，移液管等。

2)试剂。MMO-MUG培养基(IDEXX科立得Colilert试剂)，无菌水。

2.3 样品预处理

样品的预处理同1.3。选择合适稀释度的样品，对于准确测定污泥中粪大肠菌群的最大可能数具有重要意义，推荐污泥样品酶底物法稀释度范围为(质量分数)：10-3～10-8。

2.4 检测流程

量取 100 mL 稀释混匀的样品于无菌采样瓶中，加入MMO-MUG 培养基粉末，充分混匀，使培养基完全溶解；全部倒入定量盘内，释放气泡，用程控定量封口机封口。于(44.5±0.5)℃培养 24 h 后对照标准阳性板判读结果。查阅MPN表对应的 100 mL 水中粪大肠菌群的最可能数，换算得出 1 g(mL)污泥中粪大肠菌群的最可能数。

3 结果分析与对比

采集污水处理厂、医疗机构、城市排水沟3大类污泥样品共30组，分别采用多管发酵法和酶底物法检测，并对检测结果进行分析对比。

本文原始数据都以10为底，对数转化后使用EXCEL和SPSS.25统计软件进行计算和统计分析。

3.1 两种检测结果比较

对检测结果进行对比分析得出(图1)，多管发酵法个别检测结果略大于酶底物法，这是由于样品在初发酵试验之后，还需复发酵试验，在此过程中容易受到到外界因素的干扰和不确定因素的影响，以及污泥样品的不均性，造成检测结果出现较大差异的情形，而酶底物法采用先进的密封培养技术，没有二次污染[8]，且由于科立得试剂独有的抑菌功能，能抑制200万个异养菌生长，从而使出现假阳性和假阴性的概率大大降低[9]。

图1 30组污泥样品检测结果比较

3.2 试验结果分析

对30组检测结果的t-检验分析得出，相关系数(r)为：0.925。r≥0.8,说明这两种方法之间高度相关。tStat=0.447,t0.05(30)=2.045,tStat﹤t0.05(30),P=0.658。P>0.05，即两种分析方法检测结果无显著差异。结果分析见图2。

图2 检测结果的线性回归分析

3.3 两种方法精密度试验对比与分析

在该批样品中选取低浓度、中浓度、高浓度污泥样品各1份，按不同方法各进行了6次重复测定，并对精密度测试结果作分析比较。结果见表1。

从表1表明，无论是对于低浓度、中浓度，还是高浓度的样品，酶底物法的RSD%﹥多管发酵法RSD%，酶底物法重复性r明显小于多管发酵法，说明酶底物法检测数据波动较小。经F检验，低浓度、中浓度、高浓度F计算值分别为6.57、14.30、39.22。F计算值﹥F0.05，(5,5)=5.05，说明两种检测方法的精密度有显著差异，酶底物法精密度明显大于多管发酵法。

表1 多管发酵法与酶底物法精密度的比较

4 酶底物法替代多管发酵法的可行性探讨

4.1 两种检测方法的优点与缺点对比

酶底物法主要是采用先进的酶技术密封培养，易操作，检测流程短，无需确认实验，假阳性概率较低，精密度高，但材料成本相对较高，其检测费用比较昂贵，人工成本较低，可以弥补传统多管发酵法的不足。

多管发酵法，其操作步骤繁琐，整个操作过程容易受到外界环境的干扰，控制成本方面具有优势，技术操作简单，检测时间较长，需进行确认试验，准确度相对酶底物法略低，人工成本较高，大批量样品检测难度较大。两种方法的优点与缺点对比见表2。

表2 多管发酵法与酶底物法优点与缺点的对比

4.2 实验结果比较分析

对检测结果的t检验分析，两种检测方法无统计学意义上的差异，两种分析方法之间高度相关，其检测效果相同，两种方法检测结果无显著差异。

4.3 两种方法精密度检验

通过对精密度的分析，两种检测方法的精密度之间存在显著性差异，酶底物法精密度高于多管发酵法，且两种检测方法的精密度均在受控范围之内。

5 结论

随着微生物检测技术的不断提高，高效、准确、环保、低廉的微生物检测技术将是未来发展的主要方向。污泥粪大肠菌群采用酶底物法检测效果显著，与传统的多管发酵法比较检测结果基本一致，两种方法之间高度相关，无显著性差异，检测结果无系统误差。污泥粪大肠菌群酶底物法检测精密度高，操作流程简单，检测时间短，工作效率高，其检测效果高于多管发酵法，适用于各种固体类型的污泥、堆肥、肥料、土壤中的粪大肠菌群检测。酶底物法是现阶段代替传统多管发酵法最可行有效的替代方法之一。