紫丹参水溶性及脂溶性成分提取工艺优化*

朱丽媛，彭朝蕊，周木艳，赵 兴，陈光明

(云南新兴职业学院 药学院，云南 昆明 651500)

紫丹参系唇形科鼠尾草属植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensis C.H.Wright)的干燥根及根茎[1]，又名云南鼠尾草、小丹参、滇丹参等[2]，彝族语音译名为呆乃色[1]。它与著名中药丹参同属于唇形科鼠尾草属植物，且具有与丹参相似的药理活性[3]，往往作为丹参的替代品使用[4]。但紫丹参与丹参还是存在明显区别，从分布区域到化学成分中的主要成分含量、药理作用程度等都有所不同，固不可将二者混为一谈[5-9]。

紫丹参主要分布于云南、四川、贵州等省，主要来自于野外，一直作为云南地方习用药材，用药历史悠久[10]。民间主要将紫丹参用于治疗妇科和骨伤科疾病，具有活血调经、祛瘀生新、镇静止痛、除烦安神、活血通经等功效[1-2，11-14]。云南鼠尾草药材曾在云南大理州年产达 10000 kg 以上，行销华北、华中、中南和华南等各省区[15]，在大理民间常与马厂当归配伍使用[16]。紫丹参疗效广泛，含有丹参酮类、酚酸类等成分，近年来因对其抗血小板聚集、防治冠心病等现代药理作用的深入研究而日益受到重视[17-18]。以紫丹参为处方主药被国家标准收载的中药制剂多达10个，其中丹莪妇康煎膏、紫灯胶囊、紫丹活血片等均疗效显著[19-20]。目前，已有学者对紫丹参资源、化学成分、药理作用、提取工艺等方面进行了研究[17-21]，但对紫丹参的提取工艺只停留在对其水溶性或脂溶性各成分单独研究[22-25]，暂未见其脂溶性及水溶性总成分的提取工艺。本研究以丹酚酸 B 和丹参酮 IIA 总含量为指标，通过对紫丹参的提取次数、时间、料液比以及溶剂(乙醇)浓度进行单因素考察，采取回流提取法，采用正交试验设计法优选紫丹参提取工艺，为充分利用该药提供重要的依据与参考。

1 仪器与材料

1.1 药材来源

紫丹参药材购自云南省宣威市羊场镇，经云南新兴职业学院药学院杨艳娟副教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensis C.H.Wright)的干燥根及根茎。

1.2 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪(美国Agilent)；BT25S分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；CP124C-OHAUS电子天平(奥豪斯仪器常州有限公司)；JP-1500B高速多功能粉碎机(永康市久品工贸有限公司)；SK3300超声机(上海科导超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(天津泰斯制仪器有限公司)；EYELA N-1300型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

1.3 试剂

丹酚酸B对照品(批号: 20120901，森岚科技有限公司，含量：91.04%)；丹参酮IIA对照品(批号: 19032005，森岚科技有限公司，含量：94.55%)。 无水乙醇(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，德国MERCK)；甲醇(分析纯，利安隆博华医药化学有限公司)；磷酸(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；纯净水(济南哇哈哈恒枫饮料有限公司)。

2 方法与结果[26]

2.1 建立紫丹参丹酚酸 B 和丹参酮IIA测定方法

2.1.1 色谱条件

Agilent 1260高效液相色谱系统，色谱柱：中谱科技RD-C18(5 μm, 4.6×250 mm)。流动相：乙腈(A)— 0.1% 磷酸溶液(B)，梯度洗脱，0～5 min，30%～35% A; 5～10 min，35% A; 10～20 min，35%～75% A; 20～25 min，75%～80% A;25～30 min，80%～85% A;30～35 min，85%～5% A;35～40 min,5% A。流速：1 mL/min。检测波长：丹酚酸 B 286 nm，丹参酮IIA 270 nm。柱温：30 ℃。进样量：1 μL。对照品和待测样品的色谱图见图1。

图1 混标(A)和紫丹参样品(B)的HPLC色谱图

2.1.2 标准曲线绘制

精密称取丹酚酸B和丹参酮IIA对照品若干，溶于甲醇制成混合对照品母液，将母液逐级稀释成各成分质量浓度0.31～10.03 mg/mL、0.06～2.07 mg/mL 的混合对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，以纵坐标为峰面积，横坐标为对照品的质量浓度(mg/mL)制作标准曲线，拟合回归方程，结果见表1。

表1 丹酚酸 B 和丹参酮IIA的线性回归方程与相关系数及线性范围

2.1.3 供试品溶液制备

精密称定紫丹参粉末 5 g，按正交试验安排表进行试验，合并滤液浓缩至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4 方法学考察

精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 1 μL，连续进样 6 次，记录色谱图。丹酚酸B 和丹参酮IIA的RSD分别为0.17 % 和 0.33 %，表明仪器精密度好。

重复性试验 精密称定紫丹参粉末 5 g，按照供试品溶液制备方法制备，并连续进样 6 次，记录色谱图。丹酚酸B和丹参酮IIA的RSD分别为0.68 %和1.55 %，表明重复性良好。

稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别在 0、2、4、6、8、12 h 进行测定，记录色谱图。丹酚酸B和丹参酮IIA的RSD分别为0.44 %和1.72 %，表明供试品溶液在 12 h 内稳定。

加样回收试验 取已知含量的6个供试品溶液，加入一定量的丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品，按制备方法制备，测定制备含量，计算平均回收率。丹酚酸B和丹参酮IIA的平均加样回收率分别为101.47%和98.71%，RSD分别为2.40%和2.06%。

2.2 紫丹参提取工艺研究

2.2.1 单因素考察

以乙醇作为提取溶媒，对料液比、乙醇分数、提取时间进行单因素考察。

1)料液比考察。准确称取紫丹参粉末5份，每份 5 g，分别以料液比1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10(g/mL)加入 70% 乙醇，于 80 ℃ 水浴回流提取 1 h，过滤，滤液浓缩至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，测定丹酚酸B、丹参酮ⅡA的质量分数，结果见表2。

表2 料液比考察结果

2)乙醇考察。准确称取紫丹参粉末5份，每份 5 g，分别加入8倍量(40 mL)的50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇，于 80 ℃ 水浴回流提取 1 h，过滤，滤液浓缩至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，测定丹酚酸B、丹参酮ⅡA含量，结果见表3。

表3 乙醇浓度考察结果

3)提取时间考察。准确称取紫丹参粉末5份，每份 5 g，分别加入8倍量(40 mL)的70%乙醇 80 ℃ 水浴加热回流提取 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，过滤，滤液浓缩至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，测定丹酚酸B、丹参酮ⅡA含量，结果见表4。

表4 提取时间考察结果

2.2.2 正交试验方案及结果分析

在单因素试验考察的基础上，根据正交试验设计原理，以丹酚酸B、丹参酮ⅡA质量分数为评价指标，选择料液比(g/mL) (A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)进行考察，采用L9(34)正交试验设计优选紫丹参水溶性及脂溶性成分提取工艺，因素水平见表5。丹酚酸B及丹参酮ⅡA质量分数各占50%进行综合评分，结果见表6，方差分析结果见表7。

表5 正交试验因素水平表

表6 正交试验设计及直观分析表

表7 正交试验方差分析表

直观分析可知，影响丹酚酸B、丹参酮ⅡA两种成分质量分数总和的因素大小顺序为：提取时间>乙醇体积分数>料液比，且提取时间、乙醇体积分数在提取过程中起重要作用(P<0.05)，确定最佳提取参数为A2B2C3，即加入 8倍量的75%乙醇在 80 ℃ 水浴加热回流提取 120 min。

2.3 验证试验

根据正交试验结果筛选的工艺条件进行3组验证试验，结果见表8。以优化工艺作为标准进行紫丹参提取，其提取液中丹酚酸B和丹参酮IIA的含量都较高，达到 31.73 mg/g。试验表明，所优化的提取工艺合理可行，且结果稳定可靠。

表8 验证试验结果

3 讨论

本研究选择丹酚酸 B 和丹参酮 IIA 作为评价指标，因其为紫丹参的主要有效成分，在治疗心血管疾病中有很好的治疗作用，含量较其他成分高，也是水溶性成分和脂溶性成分的代表性成分，可以更全面地反映出紫丹参的提取效果。丹酚酸 B 成分遇热不稳定，为尽量减少由于干燥时丹酚酸 B 成分的损耗导致含量测定中的其提取的量降低[22]，故将样品浓缩后进行定容。

本研究中，首先采用单因素试验考察了紫丹参中丹酚酸 B 和丹参酮 IIA的提取次数、料液比、乙醇浓度、提取时间，在此基础上，采用 L9(34)正交试验设计优选紫丹参的提取工艺。结果显示，紫丹参中丹酚酸 B 和丹参酮 IIA提取效率的主要影响因素为乙醇，其次是提取次数，得到最佳提取工艺为：8倍量(40 mL)的75%乙醇在 80 ℃ 水浴加热回流提取 120 min。重复验证最佳工艺实验提取的丹酚酸 B 和丹参酮 IIA的总含量为 31.73 mg/g。表明该方法提取效率较高，重现性好，同时操作简便，可为紫丹参的进一步开发利用提供可靠依据。