ANXA1在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

营晓梅，陈 亮，吴晴晴，曹立宇，余宏铸

甲状腺癌是内分泌系统中常见肿瘤，占甲状腺结节的5%～10%。甲状腺癌约80%～85%的病理类型是甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，10年生存率可达90%以上。但有些特殊类型的PTC，具有明显的侵袭性及转移性。因此，PTC发病机制的深入研究以及寻找潜在的靶标对临床诊断具有重要的指导意义。

膜联蛋白 A1( annexin-A1，ANXA1)是与细胞膜上的磷脂结合的一类蛋白质,包含N末端、 C末端，其中C端高度保守，基本不参与细胞相关活动，而 N端参与多种组织的生理病理过程，从而影响细胞增殖、凋亡、转移和侵袭等过程。目前关于ANXA1与PTC的联系鲜有报道，为了更好的了解和检测PTC发生的分子机制，该研究验证ANXA1在PTC中表达，并比较其临床病理特征，探讨ANXA1是否可以成为PTC潜在生物标志物及预后指标。

1 材料与方法

1.1 材料

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病例资料 收集安徽医科大学附属阜阳医院2019年1月—2020年3月石蜡组织标本，其中56例PTC、26例NT、33例NG；并收集甲状腺结节组织和邻近的甲状腺正常组织或对侧甲状腺腺叶组织，在手术室中切除后用液氮进行速冻，在病理学的诊断下，确诊为PTC、NT、NG；剩余组织放入-80 ℃冰箱中储存。该研究由安徽医科大学附属阜阳医院伦理委员会授权。上述所有患者均已签署知情同意书。

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主要试剂 ANXA1抗体(ab214486)购自英国Abcam公司 ；DAB染色液(增强聚合物法)试剂盒、EDTA抗原修复液、PBS缓冲液均购自福州迈新有限公司；TRIzol购自上海Invitrogen公司；逆转录试剂盒(RR047A)和qRT-PCR试剂盒(RR0820)购自北京宝日医生物技术有限公司。

1.2 方法

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生物信息学分析 从TCGA数据库中，对获得的58例正常甲状腺组织(normal thyroid,NT)和508例甲状腺癌组织数据，进行ANXA1的差异表达分析；并对其中配对的58例NT与甲状腺癌组织进行比较；对获得的数据进行进一步分析，获得ANXA1的表达与患者总生存期的关系。

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免疫组化 将收集的石蜡标本，制成3 μm厚度切片，烤干后，二甲苯脱蜡，乙醇脱水，PBS缓冲液冲洗，EDTA修复抗原，按照DAB染色液(增强聚合物法)试剂盒说明书，依次添加过氧化物酶阻断剂、ANXA1一抗(工作浓度1 ∶28 000)、反应增强液、酶标抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色、复染、二甲苯透明、封片。最后的成片，分别由3位病理科医师采用双盲法进行相应读片，记录读片结果。

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免疫组化结果判读 免疫组化观察标准为染色强度与阳性细胞百分比的乘积，染色深浅：明显没有染色为0分，浅黄色1分，黄棕色2分，棕褐色3分。阳性细胞百分比≤5%记为0分，≤25%记为1分，≤50%为2分，≤75%为3分，75%以上可记为4分。染色强度与阳性细胞百分比所得的数值相乘<4分为低表达，分值≥4分为高表达。

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qRT

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PCR法检测 对收集到的PTC、NT及NG组织按照TRIzol试剂说明提取总RNA，并进行浓度测定，再根据逆转录试剂盒的使用说明获得cDNA，PCR扩增的条件为第一步预变性95 ℃、5 min，第二步循环40次，95 ℃、15 s，60 ℃、31 s，GAPDH作为内参，采用2法计算上述3组中ANXA1 mRNA的相对表达量。Human-ANXA1的引物(F：5′-TGTGAAGTCATCCAAAGGTGG-3′；R：5′-GCTGTGCATTGTTTCGCTTA-3′)；Human-GAPDH引物(F：5′-ACTTTGGTATCGTGGAAGGAC-3′；R：5′-AGTAGAGGCAGGGATGATGTT-3′)

1.3 统计学处理

应用SPSS 23.0软件对NT、结节性甲状腺肿(nodular goiter,NG)和PTC中免疫组化结果进行χ检验，对ANXA1 mRNA的表达结果应用方差分析，对ANXA1与临床病理参数分析应用χ检验

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺癌中ANXA1的表达情况

在TCGA网站下载的数据信息中，包含了58例NT和508例甲状腺癌组织，ANXA1在甲状腺癌中呈现高表达(

P

<0.05)，见图1。其中配对的58例癌旁NT与甲状腺癌组织中ANXA1在甲状腺癌中呈现高表达(

P

<0.05)，见图2。对ANXA1的表达与患者总生存期的数据进行相应分析后，结果显示ANXA1低表达患者的预后更差[

HR

=0.09(0.02～0.38)，

P

<0.05]，见图3。

图1 TCGA数据库中ANXA1在甲状腺癌中表达情况与正常组织组比较：*P<0.05

图2 TCGA数据库中58例配对甲状腺正常组织与甲状腺癌中AXNA1的表达情况与正常组织组比较：*P<0.05

图3 TCGA数据中ANXA1表达与甲状腺癌患者生存期关系 与ANXA1低表达组比较：*P<0.05

2.2 ANXA1蛋白在组织中表达情况

免疫组织化学染色结果显示，ANXA1在PTC中主要定位于细胞质和(或)细胞核，相比于另两组，ANXA1蛋白在PTC中呈现高表达，见图4。比较三者阳性百分率，差异有统计学意义(χ=54.336，

P

<0.01)，见表1。ANXA1蛋白在PTC组中为0.910 7 ，分别高于癌旁正常组织0.153 8(χ=46.056，

P

<0.01 ) 和NG组 0.303 0(χ=35.560，

P

<0.01)。NT和NG阳性率差异无统计学意义(χ=1.788，

P

=0.181)。

图4 ANXA1在PTC、NG、NT中的表达情况

表1 不同甲状腺组织中ANXA1的表达情况[n(%)]

2.3 ANXA1 mRNA在PTC中相对表达情况

应用qRT-PCR比较上述3组ANXA1 mRNA的相对表达量，结果显示ANXA1 mRNA在三者比较中差异有统计学意义(

F

=8.315，

P

<0.05)，且相比于NT组，ANXA1 mRNA在PTC中相对低表达，差异有统计学意义(

P

<0.05)，NG组未见明显差异，见图5。

图5 ANXA1 mRNA在NT、NG、PTC中相对表达情况

2.4 ANXA1在PTC中的表达与临床病理信息的关系

整理实验中PTC患者的临床病理信息，得出ANXA1与PTC患者的性别、年龄及临床分期差异无统计学意义，与肿瘤部位、直径、淋巴结转移差异有统计学意义(

P

<0.05)，见表2。

表2 ANXA1表达与PTC临床病理学特征的相关性(n)

3 讨论

从TCGA官网中获得58例NT和508例甲状腺癌的数据信息，分析ANXA1在两者中的表达情况，结果显示ANXA1在甲状腺癌中的表达高于NT；其中配对的58例样本中，结果同样如前所述；对ANXA1的表达水平与甲状腺癌患者总生存期的相关数据进行分析，结果提示ANXA1高表达患者的生存期长于低表达患者的生存期。因此，ANXA1表达可能与甲状腺恶性肿瘤诊断及其临床预后相关。甲状腺恶性肿瘤的发病率逐年上升。其中，PTC又是甲状腺癌中最多见的一种分型。为进一步研究PTC与ANXA1的相关情况，从安徽医科大学附属阜阳医院收集NT、NG、PTC 3种组织的石蜡标本及新鲜组织样本分别应用免疫组织化学染色和qRT-PCR技术，在ANXA1蛋白、mRNA水平进行相关验证，结果显示，相较于另两组组织，ANXA1蛋白在PTC中呈高表达水平，ANXA1 mRNA水平相较于另两组表达量呈下降趋势；在此基础上进行PTC患者临床病理特征与ANXA1的相关性研究，结果显示AXNA1的表达与患者的性别、年龄、临床分期无关，与其肿瘤部位、直径、淋巴结转移有关。

ANXA1是一种磷脂结合蛋白，其特有的生理结构使得ANXA1在炎症与肿瘤中发挥不一样的作用。在炎症中，ANXA1可以通过与FPR2/ALX结合，诱导中性粒细胞和单核细胞凋亡并抑制炎症细胞聚集，从而起到抗炎的作用。在肿瘤中，ANXA1的表达呈现上调或下调趋势，如在胰腺癌、胃癌、肺腺癌中的 ANXA1 表达上调；而在食管鳞癌、前列腺癌中呈现低表达，因此，ANXA1可以被用于疾病诊断或成为预后标志物。在ANXA1相关机制的研究报道中，有些报道显示了ANXA1在食管鳞状细胞癌、胰腺癌中，增强细胞增殖、迁移和侵袭能力；而在胰腺导管腺癌中，ANXA1降低细胞增殖并诱导癌细胞生长停滞。因此，ANXA1在不同肿瘤中有不同的表达且其相关机制具有肿瘤特异性，可以作为潜在肿瘤标志物及预后指标。