抑制自噬可以增强七叶皂苷钠对肝细胞性肝癌的抑制作用

方 超, 周大臣，崔 笑，魏 昇, 耿小平

原发性肝癌的发病率在癌症中位于第6位，病死率位于第4位，其中，肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占了75%～85%。对于HCC患者来说，主要的治疗方法包括肝脏切除、肝脏移植、射频消融、经导管动脉化疗栓塞术和药物治疗，但是这些治疗都存在一定的局限性。自噬(在此特指巨自噬)是细胞内一个重要的高度保守的分解代谢过程,可以为细胞的生长发育提供营养物质。它能够保护正常肝细胞，阻止其发生癌变，但是当HCC形成后，自噬会促进癌细胞的生长。七叶皂苷钠是中药娑罗子的一种自然提取物，先前的研究已经表明了它在HCC中的抗肿瘤作用。这篇文章主要研究七叶皂苷钠对HCC细胞自噬流的影响及自噬抑制剂氯喹对七叶皂苷钠作用效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

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主要试剂 七叶皂苷钠购自美国APExBIO公司；氯喹购自美国MCE公司；HCC细胞系Huh7、HepG2和Hep3B购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自美国Gibco公司；青霉素/链霉素、BCA试剂盒和4%多聚甲醛购自上海碧云天生物技术有限公司；DMEM购自美国Hycolne公司；0.25%胰酶购自美国Wisen公司；β-Actin，PI3K (p85)，AKT，4E-BP1，Phospho-4E-BP1 (Thr37/46)购自美国CST公司；LC3B购自美国Abcam公司；山羊抗鼠或抗兔二抗购自北京中杉金桥公司；MTT购自美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)和0.1%结晶紫购自北京索莱宝科技有限公司；Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

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主要仪器 细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司；酶标仪购自上海科华生物工程股份有限公司；CytoFLEX 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.2 方法

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细胞培养 3种细胞系(Huh7、 HepG2和Hep3B)均在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养，并放置于细胞培养箱中，培养温度为37 ℃，含有5% CO。细胞培养液每2 d更换1次，每3～5 d传1次代，用0.25%胰酶消化，所有细胞培养不超过10代。

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细胞蛋白提取及Western blot 分析 RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按照100 ∶10 ∶1的比例配制成所需的蛋白提取液，裂解细胞15 min后收集所有液体在4 ℃离心机中离心20 min，转速为13 000 r/min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白液和上样缓冲液按照比例混合，于100 ℃变性10 min。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳、转膜。将蛋白条带置于5%胎牛血清白蛋白中，在室温孵育1 h，在4 ℃冰箱孵育一抗过夜，第2天在室温孵育相应鼠抗或兔抗1 h，使用显影仪进行蛋白条带显影。

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MTT检测 细胞种植于96孔板中，每孔3 000 个细胞，100 μl培养液。第2天，用药物处理细胞48 h之后，在每个孔中加入10 μl MTT(5 mg/ml)，于细胞培养箱中孵育4 h。然后吸净培养液，每孔加入150 μl DMSO溶解结晶，振荡10 min混匀，使用酶标仪在570 nm和630 nm处测定吸光度，最终吸光度为两者差值。细胞生存率计算方法：处理组吸光度/对照组吸光度。

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克隆形成实验 细胞种植于6孔板中，每孔1 000个细胞。第2天，用药物处理细胞12 h后换成正常培养基，之后每隔2～3 d换1次培养液，并于显微镜下观察，直到形成50个细胞左右的细胞团。吸弃培养基，加入1 ml 4%多聚甲醛固定10 min。然后吸弃多聚甲醛，加入1 ml 0.1%结晶紫染色15 min，拍照，使用Image-J软件计数。

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细胞凋亡检测 使用药物处理6孔板中的细胞48 h后，消化，离心收集细胞，洗涤细胞，将5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI分别加入每一个流式管中，在室温避光孵育15 min。然后，使用CytoFLEX 流式细胞仪在1 h内检测细胞凋亡。

2 结果

2.1 七叶皂苷钠对HCC细胞自噬流的促进作用

根据先前的研究结果，确定了七叶皂苷钠的浓度为40 μmol/L。在其处理3种细胞系(Huh7、HepG2和Hep3B)24 h后，Western blot结果显示，与对照组相比，七叶皂苷钠上调了LC3B蛋白的表达水平(图1)。另外，当七叶皂苷钠和氯喹联合使用12 h后，联合处理组的LC3B蛋白表达量高于七叶皂苷钠和氯喹单独处理组(图2)。

图1 七叶皂苷钠处理细胞24 h后LC3B蛋白表达量Con：对照组；SA：七叶皂苷钠处理组，浓度为40 μmol/L

图2 七叶皂苷钠和氯喹联合用药12 h后LC3B蛋白表达量

2.2 七叶皂苷钠对PI3K/AKT信号通路的抑制作用

七叶皂苷钠抑制了Huh7和HepG2细胞内PI3K/AKT信号通路。Western blot结果表明，七叶皂苷钠抑制了PI3K以及AKT的表达。此外，七叶皂苷钠还下调了蛋白4EBP1的表达并抑制了其磷酸化水平(图3)。

图3 七叶皂苷钠处理细胞48 h后PI3K/AKT通路蛋白表达量Con：对照组；SA：七叶皂苷钠处理组，浓度为40 μmol/L

2.3 氯喹对七叶皂苷钠抗肿瘤效果的增强作用

在HCC细胞系(Huh7、HepG2和Hep3B)中，七叶皂苷钠和氯喹联合应用48 h后，与对照组或者单独用药相比，细胞生存率降低，差异有统计学意义(3种细胞系中，

F

值分别为711.90、63.89和146.30，

P

<0.05)(图4)。此外，联合用药48 h后，Huh7[

F

=17.33；七叶皂苷钠

vs

联合用药：(5.52±2.33)%

vs

(13.53±3.19)%，

P

=0.006 7]和HepG2[

F

=158.00；七叶皂苷钠

vs

联合用药：(31.15±3.56)%

vs

(51.76±2.51)%，

P

<0.001]细胞的早期凋亡率增加(图5)。同时，七叶皂苷钠和氯喹联合处理细胞12 h后，Huh7[

F

=1 789.00；七叶皂苷钠

vs

联合用药：(71.00±3.61)

vs

(9.00±3.61)，

P

<0.001]和HepG2[

F

=1 731.00；七叶皂苷钠

vs

联合用药：(225.30±22.19)

vs

(95.00±9.17)，

P

<0.001]的细胞克隆数减少(图6)。

图4 药物处理48 h后MTT检测结果

图5 药物处理48 h后细胞凋亡检测结果

图6 药物处理12 h后细胞克隆形成能力测定结果

3 讨论

LC3B-II蛋白是自噬小体形成的一个重要标志，主要是通过细胞内的LC3B-I蛋白与磷脂酰乙醇胺(PE)结合而形成。在该研究中，七叶皂苷钠作用后的HCC细胞，LC3B-II蛋白的表达水平明显增加，间接表明七叶皂苷钠可以诱导HCC细胞产生大量的自噬小体。而自噬小体的大量增加一般有两个原因，一是因为自噬流的分解过程被阻断，自噬小体不能被降解，沉积在细胞内；另一个原因是自噬流增加，自噬小体的合成增加了。当氯喹被使用去抑制自噬流的分解过程时，七叶皂苷钠诱导形成的LC3B-II蛋白表达量反而比单独用药时更高，表明自噬小体的增加是由于它的合成增加，而不是自噬小体的降解被抑制。因此，综合这些研究结果可以证实七叶皂苷钠确实能够诱导HCC细胞的自噬流。

至于具体的分子机制，该研究表明七叶皂苷钠可以下调PI3K和AKT蛋白，而且mTOR的下游蛋白4EBP1的磷酸化也被抑制了。通过这个结果，可以推测七叶皂苷钠抑制了PI3K/AKT信号通路，并且也抑制了mTOR蛋白的表达，因此，其促进了HCC细胞的自噬流。

尽管已经证实七叶皂苷钠确实促进了HCC细胞的自噬流，但是这个上调的自噬流在HCC细胞中所起的作用以及对七叶皂苷钠的影响还不是很明确。从目前已知的情况来看，自噬在HCC中所发挥的作用是十分复杂多变的。它能够将细胞内衰老的细胞器，错误折叠的蛋白等降解成小分子物质(核苷、氨基酸、脂肪酸等)，这样既可以维持细胞内环境的稳定，也可以为细胞提供生长所必需的营养物质，所以从这个角度来看，它可以促进HCC细胞的生长，帮助癌细胞在一些应激环境下生存，甚至适应这些环境。然而另一方面，自噬能够通过抑制HCC细胞中的炎症反应来抑制癌细胞生长，并且自噬介导的自噬性细胞死亡也是杀伤癌细胞的一种方式，一些研究表明促进自噬流可以延缓HCC的发展，而抑制自噬流则有利于HCC的发展。

为了弄清楚七叶皂苷钠诱导的自噬流对HCC细胞的影响，氯喹被用来抑制HCC细胞的自噬流。实验结果显示，当自噬流被抑制时，七叶皂苷钠可以进一步降低癌细胞的生存率，促进细胞早期凋亡，抑制细胞克隆形成能力。这些发现表明抑制自噬可以增强七叶皂苷钠的作用效果，也就是说七叶皂苷钠诱导的自噬是保护性的。当七叶皂苷钠杀伤癌细胞时，细胞会产生更多的自噬流，为其自身提供营养物质，维持生长，保护细胞，在一定程度上抵消了药物的作用效果。因此，当HCC细胞的自噬流被氯喹阻断时，癌细胞失去了这个保护作用，导致七叶皂苷钠的抗肿瘤效果变强了。

综上所述，七叶皂苷钠可以增加HCC的自噬流，并且通过阻断自噬流，可以增强七叶皂苷钠的作用效果。