C-Myc通过调控lncRNA NEAT1对口腔鳞癌细胞增殖作用的研究

许玉俊，朱友明， 何家才，3

口腔恶性肿瘤是世界第6大常见癌症，近些年其发病率在中国呈上升趋势。大部分恶性肿瘤细胞即使在氧供充足的情况下，其葡萄糖代谢也倾向于糖酵解，从而发生“有氧糖酵解”现象，即“Warburg效应”。有氧糖酵解不仅能够为肿瘤细胞提供增殖所需的能量，也能够为新生的肿瘤细胞提供合成代谢的底物。据报道，C-Myc参与细胞凋亡，而且与多种恶性肿瘤的发生及发展有关。研究表明，长链非编码RNA核富集转录本1(long non-coding RNA nuclear enriched abundant transcript 1，lncRNA NEAT1)在多种恶性肿瘤中的表达水平呈现异常，但是，其表达量上调的机制还未完全清楚。该实验拟探讨C-Myc和lncRNA NEAT1在口腔癌细胞中的调控关系以及lncRNA NEAT1对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma ，OSCC)细胞糖酵解水平的调节机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取15例安徽医科大学第一附属医院和安徽省口腔医院颌面外科初诊确认为口腔癌的患者的口腔癌组织及正常癌旁组织。所有口腔癌患者术前均未进行过放化疗等治疗。标本置于冻存管内，编号，液氮中保存待用，记录相关信息。

1.2 主要材料

OSCC3、人胚胎肾细胞293T、大肠杆菌DH5α(安徽省口腔疾病研究重点实验室保存)；胎牛血清购自美国康宁生命科学有限公司；噻唑蓝(MTT)试剂、RIPA裂解液、Bradford蛋白浓度测定盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；TRIzol细胞裂解试剂购自美国赛默飞世尔科技公司；逆转录试剂购自日本宝生物工程有限公司。载体质粒 plko.1、pCDH，慢病毒包装质粒pRev、pGag、pVsvg、pAX2、pMD2，表达载体plko.1-shc-Myc、对照组plko.1-shctrl、flag-c-Myc，对照组flag空载(中国科学技术大学生科院提供)；表达载体plko.1-shlnc-NEAT1(plko.1-shlncNEAT1 AAGTCCAAAAGGAGCACT)及对照组 plko.1-shConctrol(该实验室构建)；lnc-NEAT1、对照组Control质粒、PCR引物(由上海生工技术服务有限公司设计合成，pCDH-lnc-NEAT1载体的引物，上游引物：GCGAATTCGCAAAAGTTGTGGCAAGTCCAGCC；下游引物：GCGGATCCTACCCACCATTCCCTTCTCCTAGT)(中国科学技术大学生科院实验室提供)。

1.3 方法

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细胞培养及传代 OSCC3、293T细胞用10% 胎牛血清以及1%青-链霉素双抗的DMEM培养液置37 ℃、5% CO的培养箱中培养，每3 d换1次液；待细胞融合至80%时，消化、传代，继续培养。

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构建表达载体plko.1-shlnc-NEAT1、包装慢病毒和转染OSCC3细胞 根据shlnc-NEAT1 AAGT CCAAAAGGAGCACT，合成plko.1-shlnc-NEAT1。扩增目的片段，回收。37 ℃水浴酶切目的片段和质粒载体 plko1，连接产物和载体。连接产物转入感受态的大肠杆菌DH5α体内，涂于Luria-Bertani培养基上，培养箱倒置过夜、筛选、测序鉴定，成功构建plko.1-shlnc-NEAT1。慢病毒包装:消化293T细胞，6孔板内培养，待细胞融合至50%时，用上述携带目的片段的表达载体(2 μg)和病毒包装质粒(2 μg pRev、2 μg pGag、1 μg pVsvg)共转染293T细胞，培养48 h后，收集病毒上清液，过滤、分装、-80 ℃保存。慢病毒转染：病毒感染前24 h，消化OSCC3细胞，铺6孔板，待细胞融合为30% 时，上述病毒液感染OSCC3，同时加入2 μl的8×10g/L 聚凝胺，培养24 h、换液，继续培养。

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构建表达载体pCDH-lnc-NEAT1、包装慢病毒和转染OSCC3细胞 由上海生工技术服务有限公司设计pCDH-lnc-NEAT1载体的引物，上游引物： GCGAATTCGCAAAAGTTGTGGCAAGTCCAGCC；下游引物：GCGGATCCTACCCACCATTCCCTTCTCCTAGT，合成pCDH-lnc-NEAT1。扩增目的片段，回收。水浴双酶切基因片段和质粒载体pCDH，连接产物和载体。连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α内，涂布于Luria-Bertani培养基上，培养箱内倒置过夜、筛选、测序鉴定，成功构建pCDH-lnc-NEAT1。慢病毒包装:消化293T细胞，6孔板内培养，待细胞融合50%时，用上述携带目的片段的表达载体(2 μg)和病毒包装质粒(3 μg pAX2、2 μg pMD2)共转染293T细胞，培养48 h后，收集病毒上清液，过滤、分装、-80 ℃保存。慢病毒转染：病毒感染前24 h，消化OSCC3细胞，铺6孔板，待细胞融合为30%时，上述病毒液感染OSCC3，同时加入2 μl的8×10g/L聚凝胺，培养24 h、换液，继续培养。

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qRT-PCR检测lnc-NEAT1的表达水平 提取 plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc、plko.1-shlnc-NEAT1、lnc-NEAT1及其各自对照组的总RNA。逆转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。lncRNA NEAT1上游引物：CCAGGGTGGTGGCAGTGCTCC，下游引物：CACCCCAGCCTCAGCGGGAAG ；Actin上游引物：TCCATCATGAAGTGTGACG，下游引物：TACTCCTGCTTGCTGATCCAC。将配制好的扩增体系依次按顺序加入8连管中，每组设置3个复孔，上机设置反应程序，预变性：95 ℃、2 min； PCR反应：95 ℃、5 s；60 ℃、15 s；72 ℃、 20 s，循环40次。记录结果，以Actin作为分子内标，采用2法比较分析各组 lncRNA NEAT1的表达量。

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Western blot检测C-Myc蛋白的表达 RIPA裂解 plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc及其各自对照组的OSCC3细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，煮蛋白，凝胶电泳分离蛋白，转膜，室温下封闭2 h，抗体孵育，TBST充分洗膜，显影，分析条带灰度。

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MTT比色法检测OSCC3细胞生长 将转染shlnc-NEAT1以及lnc-NEAT1后的OSCC3细胞按2×10个/孔接种于96孔板，每组设置3个复孔，培养箱内分别培养 6、12、24、48、72 h，每孔依次加入 MTT试剂 10 μl(5 g/L)，继续培养4 h后，吸除各孔培养液，每孔加入DMSO 100 μl，低速振荡10 min，检测各孔吸光度值，绘制细胞生长曲线。

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糖酵解压力检测OSCC3细胞能量代谢 将转染lnc-NEAT1以及其对照组的OSCC3细胞按2×10个/孔传代到安捷伦Seahorse XFe 96孔板，Seahorse基础培养基加入1 mmol/L谷氨酰胺，预热培养基到37 ℃，用0.1 mol/L NaO调节pH至7.4，继续37 ℃保温；96孔板每孔加入糖酵解压力试剂后，按既定的糖酵解压力程序开始检测；结束后，对每孔的OSCC3细胞进行定量，根据结果再用Seahorse 结果分析软件输出结果。

2 结果

2.1 目标lncRNA的确定

检测shctrl和shc-Myc的OSCC3细胞中lncRNA的表达情况。相关的长链非编码RNA的表达已不同程度地下降。经过筛选后，筛选出3个目的长链非编码RNA，分别为lncRNA H19、lncRNA NEAT1、lncRNA SNHG1；经过大量的文献阅读，得知长链非编码RNA NEAT1参与多种肿瘤细胞的发生、增殖以及发展。同时，当C-Myc基因下调，结果中检测到长链非编码RNA NEAT1表达量降低，而且差异有统计学意义(

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<0.05)。长链非编码RNA NEAT1与口腔癌细胞的发生以及增殖，还未见详尽的报道，因此，该课题组选择了长链非编码RNA NEAT1。lncRNA检测数据见图1。

图1 敲低C-MycOSCC3细胞中lncRNA表达量变化与shctrl对照组比较：*P<0.05

2.2 口腔癌组织中lncRNA表达情况

15例癌组织中有13例组织lncRNA NEAT1表达量高于癌旁组织，10例口腔癌组织lncRNA NEAT1表达量高于癌旁组织的2倍多。结果显示，lncRAN NEAT1在口腔癌组织中的高表达可能与口腔癌发展有关(

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<0.05)，见图2。

图2 口腔癌组织以及癌旁组织中lncRNA NEAT1表达水平与癌旁组织组比较：*P<0.05

2.3 上调C-Myc对OSCC3细胞中lncRNA NEAT1表达的影响

Western blot检测结果显示flag-c-Myc组蛋白表达较flag对照组增高，见图3A。qRT-PCR检测结果显示flag-c-Myc组lncRNA NEAT1的表达量高于flag对照组，见图 3B。结果显示，上调C-Myc可能提高OSCC3细胞的lncRNA NEAT1的表达水平(

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<0.05)。

图3 上调C-Myc对OSCC3细胞中lncRNA NEAT1表达水平的影响

2.4 敲低C-Myc对OSCC3细胞中lncRNA NEAT1表达的影响

Western blot检测结果显示，与shctrl对照组比较，shc-Myc组C-Myc蛋白表达降低，见图4A。qRT-PCR检测结果显示shc-Myc组lncRNA NEAT1表达量较shctr对照组降低，见图4B。结果显示，敲低C-Myc可能降低OSCC3细胞的lncRNA NEAT1的表达水平(

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<0.05)。

图4 敲低C-Myc对OSCC3细胞中lncRNA NEAT1表达水平的影响

2.5 上调lncRNA NEAT1对OSCC3细胞增殖能力的影响

qRT-PCR检测lncRNA NEAT1组和对照(Control)组OSCC3细胞中lncRNA NEAT1表达水平。结果显示，lncRNA NEAT1组OSCC3细胞中lncRNA NEAT1过表达(

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<0.05)，见图5A。MTT比色法检测两组细胞的增殖能力。结果显示，与Control组相比，lncRNA NEAT1组转染12 h时细胞增殖能力开始增加，直到72 h细胞增殖能力一直处于增加状态，见图5B。结果显示，上调OSCC3细胞中lncRNA NEAT1，可能促进细胞增殖能力(

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<0.05)。

图5 上调lncRNA NEAT1对OSCC3细胞增殖能力的影响

2.6 敲低lncRNA NEAT1对OSCC3细胞增殖能力的影响

qRT-PCR检测shlncRNA NEAT1组和对照(shControl)组OSCC3细胞中lncRNA NEAT1表达水平。结果显示，shlncRNA NEAT1组OSCC3细胞中lncRNA NEAT1表达量降低(

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<0.05)，见图6A。MTT比色法检测两组细胞的增殖能力。结果显示，与shControl组相比，shlncRNA NEAT1组转染12 h时细胞增殖能力开始降低，直到72 h细胞增殖能力仍然持续降低，见图6B。结果显示，敲低OSCC3细胞中lncRNA NEAT1的表达可能降低细胞的增殖能力(

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<0.05)。

图6 敲低lncRNA NEAT1对OSCC3细胞增殖能力的影响

2.7 上调lncRNA NEAT1对OSCC3细胞的糖酵解水平的影响

糖酵解压力实验检测上调lncRNA NEAT1的OSCC3细胞中的糖酵解产酸速率以及产生ATP的水平。结果显示， lncRNA NEAT1组较Control组细胞糖酵解相对产酸速率以及产生ATP的相对水平均提高，见图7A、B。因此，上调lncRNA NEAT1可能促进OSCC3细胞的糖酵解水平(

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<0.05)。

图7 上调lncRNA NEAT1对OSCC3细胞的糖酵解水平的影响

3 讨论

Myc基因属于原癌基因和调节基因，L-myc、N-myc和C-Myc组成了Myc基因，它们分别定位于1号染色体、2号染色体和8号染色体。根据Fan et al研究表明，失调的C-Myc可以与低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF1)共同作用于己糖激酶2(hexokinase 2 ，HK2)和丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1)，影响线粒体氧化磷酸化作用，从而促进糖酵解。有研究表明，C-Myc可能通过负性调控lncRNA55，影响舌鳞癌细胞的生长。

lncRNA NEAT1是细胞核内的一个lncRNA，可以与一些核内蛋白结合形成亚核结构旁斑。据报道,lncRNA NEAT1在多种肿瘤中高表达，参与肿瘤的发展。研究表明，下调的lncRNA NEAT1通过减弱miR-193对肿瘤的促进作用，抑制肿瘤的发展。此外，lncRNA NEAT1通过负性调控miR-139-5p，促进其靶基因CDK6的表达，加速胶质瘤的进展。在子宫内膜癌中，lncRNA NEAT1靶向miR-146b-5p/MMP9分子轴，通过β-catenin/Wnt信号通路，参与子宫内膜癌的发展。在骨肉瘤中，高表达的lncRNA NEAT1通过负性调控miR-339-5p/TGF-β1，促进骨肉瘤的发展。

虽然，大量研究表明lncRNA NEAT1在多种恶性肿瘤中的表达水平呈现异常，然而，lncRNA NEAT1对口腔癌细胞的调控，迄今还未见详尽的报道。该实验通过将表达载体plko.1-shc-Myc以及flag-c-Myc转染至OSCC3细胞中，检测lncRNA NEAT1表达量，结果显示过表达或者敲低C-Myc，lncRNA NEAT1的表达量呈现升高或者降低趋势，推测C-Myc与lncRNA NEAT1的表达量可能呈现正相关关系。为进一步评估lncRNA NEAT1在OSCC3细胞的生物学功能，构建表达载体 plko.1-shlnc-NEAT1以及pCDH-lnc-NEAT1转染至OSCC3细胞，检测OSCC3 细胞的增殖水平，结果显示过表达lncRNA NEAT1可能促进OSCC3细胞的增殖能力。糖酵解压力实验结果显示过表达的lncRNA NEAT1可能提高OSCC3细胞的糖酵解水平，增强细胞的糖酵解代谢。

因此，在OSCC3细胞中C-Myc可能调控lncRNA NEAT1的表达，并且lncRNA NEAT1过表达可能提高OSCC3细胞的糖酵解代谢水平，促进口腔癌细胞的增殖能力以及口腔癌的发展。