光动力疗法对牙龈卟啉单胞菌和福赛坦菌生物膜的抗菌效果

陈 晨，何家才

种植体周围炎是一种发生在种植体周围组织与牙菌斑相关的病理性疾病，其特征是种植体周围黏膜发炎，随后支持骨丧失。有报道称种植体周围炎是由革兰阴性细菌感染所引起的，如牙龈卟啉单胞菌(

Porphyromonas

gingivalis

，

P

gingivalis

)和福赛坦菌(

Tannerellaforsythia

，

T

forsythia

)。机械清创术因其一定的临床操作风险而慎用，抗生素疗法也会导致耐药菌的产生。目前，尚缺乏种植体周围炎有效的临床治疗方法。自1999年第1个光动力治疗药物被批准以来，光动力疗法( photodynamic therapy ,PDT)由于其侵袭性和重复性极小且无诱导耐药性而成为一种引人注目的治疗方式。光动力治疗结合光敏剂和可见光，在氧的存在下产生对细菌有毒的细胞毒性活性氧(reactive oxygen species ,ROS)，如单线态氧。该文旨在研究新型光敏剂NHS-BODIPY-Br在体外对

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和

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生物膜的抗菌作用，以期为种植体周围炎的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

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(ATCC 33277,美国模式培养物集存库)；

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forsythia

(ATCC 43037,美国模式培养物集存库)；光敏剂NHS-BODIPY-Br(中国科学技术大学化学与材料科学学院提供)；胰酶消化液(上海碧云天生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)；阿尔玛蓝试剂盒、显色基质法鲎试剂盒、PBS缓冲剂(美国Solarbio公司)；活/死染试剂盒、CO恒温孵箱(美国赛默飞公司)；DMEM培养液(美国Gbico公司)；脑心浸液肉汤、氯化血红素、脱纤维羊血、0.02%维生素K1(青岛海博生物公司)；680 nm半导体激光治疗仪(中国远明激光公司)；激光扫描共聚焦显微镜880(德国zeiss公司)；厌氧培养箱(英国DWS公司)；酶标仪(美国bio-tex公司)。

1.2 方法

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光敏剂的准备 将光敏剂NHS-BODIPY-Br在PBS中稀释成不同浓度：5、10、15 mg/L。制备好的光敏剂在容器中避光以消除反应，并在8 ℃下保存备用。

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2

细胞增殖实验 从该课题组取SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行培养，取P3代进行实验。将BMSCs以4×10个/ml的密度接种于96孔板中。培养24 h待细胞贴壁后吸出培养液，用PBS清洗，将不同浓度的NHS-BODIPY-Br加入，没有加光敏剂的细胞作为对照组。分别在培养第1、3、5天将CCK-8以1 ∶9的比例加入DMEM培养液中，将细胞培养板置于37 ℃恒温培养箱中2 h，随后在450 nm波长处检测各孔的吸光度。每组设6个复孔，实验重复3次。

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3

生物膜的培养 将

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接种在BHI固体培养基上 ,在厌氧培养箱中培养7 d后收获菌落。用 PBS 稀释细菌并采用麦氏比浊法配制成细菌悬浊液2.5×10～3.5×10CFU/ml。将0.1 ml的细菌接种在96孔板中，在37 ℃厌氧箱中培养48 h，获得的生物膜用于阿尔玛蓝和脂多糖实验。将1 ml同样密度的细菌接种在共聚焦培养皿上，厌氧培养48 h获得的生物膜用于激光共聚焦荧光成像。

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光动力治疗 去除培养液后，在96孔板中加入0.02 ml不同浓度的光敏剂，在共聚焦培养皿中加入1 ml光敏剂，反应5 min后去除光敏剂，使用680 nm波长，光剂量为150 mw/cm的二极管激光器工作100和200 s，分别对应15和30 J/cm。

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5

阿尔玛蓝活力分析 激光处理结束后，阿尔玛蓝溶液以1 ∶10的比例加至培养液中，96孔板每孔中加入0.1 ml该混合液后在37 ℃培养箱中培养20 min。以600 nm作为参考波长，在570 nm波长下用酶标仪读取吸光度值。没有加入光敏剂的细菌作为对照组。吸光度减少率(%)计算如下：(对照组阿尔玛蓝的吸光度-光动力治疗后阿尔玛蓝的吸光度)/对照组阿尔玛蓝的吸光度×100%。每组设6个复孔，实验重复3次。

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6

脂多糖检测 在光动力治疗后，剩余的脂多糖浓度通过内毒素检测试剂盒来定量。加入细菌没有光照的是阳性对照组，没有加入细菌的是阴性对照组。在545 nm处读取吸光度的结果。每组设6个复孔，实验重复3次。

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7

共聚焦 光动力治疗后，在每个共聚焦培养皿中加入1 ml的活/死染溶液，反应20 min后吸出溶液，用PBS清洗3次后用于共聚焦显微镜观察。对照组未进行激光照射。每个治疗组设3个重复皿。图片使用软件ZEN进行分析。

2 结果

2.1 NHS-BODIPY-Br浓度对BMSCs细胞增殖的影响

与对照组相比，A、B、C组细胞吸光度值无明显差异(

F

=1.715、2.112、1.037,

P

>0.05)，差异无统计学意义。见图1、表1。

图1 CCK-8检测不同浓度光敏剂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响A组:5 mg/L; B组:10 mg/L; C组:15 mg/L

表1 CCK8检测不同时间和组别的细胞OD值

2.2 NHS-BODIPY-Br浓度和光照时间对细菌活力的影响

不同浓度的NHS-BODIPY-Br经过光照0、100、200 s处理后，阿尔玛蓝检测结果显示生物膜的减少率持续上升(

F

=28.882、60.525、36.923，

P

<0.05)。例如，当NHS-BODIPY-Br浓度5 mg/L，光照0 s时细菌减少约17%，光照100 s时细菌减少率约67%，光照200 s时减少率约78%。值得注意的是，当NHS-BODIPY-Br浓度10 mg/L和15 mg/L，光照100 s和光照200 s时细菌的减少率均接近98%，差异无统计学意义。见图2、表2。

图2 阿尔玛蓝检测结果

表2 阿尔玛蓝检测不同光敏剂浓度和光照时间对细菌生物膜的减少率

2.3 NHS-BODIPY-Br浓度和光照时间对细菌脂多糖水平的影响

不同浓度的NHS-BODIPY-Br经过光照0、100、200 s处理后，脂多糖检测结果显示残余生物膜脂多糖的吸光度值持续下降(

F

=41.095、69.514、17.840，

P

<0.05)。当NHS-BODIPY-Br浓度10 mg/L和15 mg/L，光照100 s和200 s时，残余的脂多糖水平与阴性对照组相比，差异无统计学意义。见图3。

图3 残余脂多糖水平

2.4 不同NHS-BODIPY-Br浓度和光照时间处理后的共聚焦显微镜成像

图4A显示的是对照组的死活染。从图中绿色荧光度可看出对照组细菌存活水平显著。图4B、E中红色荧光和绿色荧光相间，当NHS-BODIPY-Br浓度5 mg/L，光照100 s和200 s时还有存活的细菌。图4C、D、F、G中红色荧光度丰富，整个生物膜中没有活的细菌菌落。

图4 共聚焦荧光成像 ×20

3 讨论

近年来，光动力治疗作为种植体周围炎的辅助治疗手段引起了越来越多的关注。与传统疗法相比，PDT有一些优势。光动力学疗法已在医学上用于肿瘤的治疗，并建议将其用于消除龈下微生物从而对根表面进行更好的灭菌。该研究以NHS-BODIPY-Br作为光敏剂，680 nm半导体激光作为光源，评估了PDT对

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生物膜的抗菌作用。该实验使用的BODITY类光敏剂在光动力治疗中展示出其独特的优越性，其吸收峰值为680 nm波长，化学性质稳定，摩尔消光系数高，暗毒性低，其中溴原子的加入使系间穿梭效率明显提升，单线态氧量子产率得到明显改善，达到0.76。紫外线被证明对口腔微生物具有出色的抗菌功效。然而，紫外线的照射可能导致DNA损伤和紫外线引起的皮肤损伤，而可见光和近红外光被认为是安全的。而且激光可以改变牙本质，从而使胶原纤维暴露，胶原蛋白可促进血凝块的附着和稳定。所以该文使用的是一种低功率的半导体激光治疗仪，大量研究表明只要参数设置合理，使用方法正确，就不会造成牙根和牙周组织的损害。该研究的实验组与对照组样品相比，CCK-8的结果并未随着NHS-BODIPY-Br的加入而降低，表明NHS-BODIPY-Br对细胞无毒性，表明了NHS-BODIPY-Br具有生物相容性。通过阿尔玛蓝来检测不同光敏剂浓度以及光照时间细菌生物膜的减少率，当NHS-BODIPY-Br浓度越高，光照时间越久，细菌的减少率越高,这与Umeda et al使用光敏剂亚甲基蓝的结果一致。脂多糖是革兰阴性菌如

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gingivalis

的主要细胞壁成分，残余脂多糖水平的多少可以间接反应残余的细菌数量。NHS-BODIPY-Br浓度10 mg/L，光强度15 J/cm时脂多糖含量接近阴性对照组的含量，这与细菌活力的结果一致。该研究中共聚焦荧光显微镜成像显示当NHS-BODIPY-Br浓度10 mg/L，光强度15 J/cm时能完全杀灭生物膜中的细菌，光动力治疗可以激活敏化细胞产生ROS，从而促进细菌的死亡。目前研究的一个局限是生物膜的厚度相对较低。该研究是双种群生物膜生长2 d，不能完全代表一个真正口腔环境的复杂性，因此，未来的研究必须考虑生物膜厚度的变化。

革兰阴性细菌的细胞包膜是一种较为复杂且相对不易渗透的结构，由内质膜和外膜组成，外膜由肽聚糖层隔开，而且由于抗菌药物难以有效穿透生物膜致其在生物膜内活性较低。因此，选择PDT作为替代疗法很重要。Fontana et al通过激光共聚焦扫描显微镜表明，亚甲基蓝对生物膜敏感性降低的原因是亚甲基蓝穿透生物膜的渗透性降低，导致在生物膜外层滞留，而且吩噻嗪类光敏剂如亚甲基蓝、甲苯胺蓝O等是细菌多药耐药泵的底物。但是该研究中当NHS-BODIPY-Br浓度10 mg/L，光强度15 J/cm时，整个生物膜中的细菌完全被杀死，说明光敏剂NHS-BODIPY-Br在整个生物膜中无处不在。而且光敏剂NHS-BODIPY-Br负载于具有良好水溶性的纳米药物载体中，这可能是它能穿透细菌生物膜的原因。