糖尿病肾病患者肾脏巨噬细胞Bruton酪氨酸激酶激活与肾功能的相关性研究

聂振勇，赵 晶，孙璇君，吴永贵

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的主要并发症之一，并已成为全世界终末期肾脏疾病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因，目前缺乏有效的治疗手段。DN的病理学改变主要包括系膜细胞的增殖和细胞外基质的累积，基底膜的增厚，肾小管及间质的损伤和纤维化。近年来，越来越多的研究表明，巨噬细胞介导的炎症在DN中起着至关重要的作用。在DN的高血糖微环境下，巨噬细胞可以分泌多种促炎介质，其中包括白介素(interleukin, IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein, MCP)-1，进而导致肾脏内的炎症和纤维化，加速疾病的进展。Bruton酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase,BTK)是一种非受体酪氨酸激酶，是多种免疫受体下游细胞内信号传递的关键蛋白。已有大量研究表明BTK可以参与体内的多种炎症免疫反应，并参与了多种促炎介质的产生和释放。课题组前期研究表明，高糖可以诱导巨噬细胞内BTK激活，引起巨噬细胞促炎介质的释放，并且BTK敲除可以减轻炎症，缓解糖尿病小鼠的肾脏损害。在此基础上，该实验旨在研究BTK激活在DN肾脏中的重要作用，为临床的干预治疗提供线索。

1 材料与方法

1.1 病例资料

对照组：收集体检正常志愿者血清18例及癌旁正常肾组织18例作为对照组。DN组：收集2016年1月—2020年1月在安徽医科大学第一附属医院住院治疗的DN患者肾组织为DN组，共49例。入组标准：18～60岁、诊断符合《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》的诊断标准、肾脏穿刺活检确诊为DN的患者。排除标准：妊娠或哺乳期妇女、合并其他继发性肾病、入组前应用激素或免疫抑制剂、近1月有泌尿系或其他系统感染病史、有其他器官严重的功能不全、恶性肿瘤患者。临床资料包括性别、年龄、糖化血红蛋白、体质指数(body mass index,BMI)、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)、24 h尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮、估计肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、血尿酸。所有入组者均签署知情同意书，该研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会审核通过。

1.2 试剂与仪器

人IL-1β、TNF-α和MCP-1 ELISA试剂盒购自广州锐博生物有限公司；TNF-α、CD68单克隆抗体购自台湾Arigo Biolaboratories公司；BTK、Phospho-BTK单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；iNOS单克隆抗体购自英国 Abcam公司；免疫组化试剂盒( PV-9000)购自北京中杉金桥公司；免疫荧光二抗鼠Alexa Fluor 594 和兔 Alexa Fluor 488购自武汉三鹰生物技术有限公司；激光共聚焦显微镜LSM880购自德国Leica公司。病理切片标准：肾小球数目≥8个，经2位病理专家独立诊断确诊为DN。病理评级参考肾脏病理学会(RPS)2010年发表的糖尿病肾病的病理分类。

1.3 方法

1

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3

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1

ELISA实验 收集各组血清，并通过ELISA检测各组血清中IL-1β，TNF-α和MCP-1表达，检测步骤参考说明书进行。

1

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3

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2

免疫组化实验 肾组织切片常规脱蜡至水化，依次经内源性过氧化物酶阻断剂封闭，高压法修复抗原，10%山羊血清封闭，滴加一抗TNF-α(1 ∶200)、CD68(1 ∶200)、BTK(1 ∶400)，4 ℃孵育过夜(大于8 h)，冲洗后滴加二抗(辣根酶标山羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物)，37 ℃孵育30 min，冲洗后进行DAB显色。所有切片在显微镜下随机拍摄10个视野，通过Image J软件进行半定量分析，计算棕色阳性位点或棕色阳性面积占比，最后计算出各组平均值用于统计学分析。

1

.

3

.

3

免疫荧光实验 肾组织切片常规脱蜡至水化，依次经内源性过氧化物酶阻断剂封闭，高压法修复抗原，10%山羊血清封闭，滴加一抗CD68(1 ∶200)、iNOS(1 ∶200)、BTK(1 ∶400)、p-BTK(1 ∶200)，4 ℃孵育过夜，冲洗后滴加二抗(抗小鼠 Alexa Fluor 594 和抗兔 Alexa Fluor 488)，室温下避光孵育2 h，DAPI染核10 min，甘油封片后在激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果

2.1 一般临床指标

与对照组相比，DN组糖化血红蛋白、SBP、DBP、MAP、24 h尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮、血尿酸明显升高，eGFR明显下降，差异有统计学意义(

t

=7.726，

t

=2.959，

t

=2.219，

t

=2.828，

Z

=-6.083，

Z

=-5.333，

t

=4.894，

t

=4.240，

t

=6.394，均

P

<0.05)；年龄、性别及BMI差异无统计学意义。见表1。

表1 对照组及DN组的一般临床指标比较

2.2 各组血清及肾脏中炎症变化

ELISA结果显示，与对照组相比，DN组血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1均明显升高，差异有统计学意义(

t

=3.868，

t

=3.088，

t

=13.690，均

P

<0.05)，提示DN患者血清中炎症介质增加。见图1A。免疫组化结果显示，DN组肾脏中TNF-α表达高于对照组(

t

=3.418，

P

<0.05)，提示DN患者肾组织中炎症同样增加。见图1B。

图1 各组血清中IL-1β、TNF-α和MCP-1表达及肾脏中TNF-α表达差异

2.3 各组肾组织CD68、BTK、p-BTK表达变化

免疫组化结果显示，相较于对照组，DN组肾小球和肾小管中的CD68、BTK和p-BTK表达均明显增加(

t

=5.774，

t

=6.119，

t

=4.542，

t

=7.315，

t

=6.760，

t

=7.610，均

P

<0.05)，提示DN患者肾组织中巨噬细胞浸润增加，并伴有BTK表达与激活增加。见图2。

图2 各组肾组织中CD68、BTK及p-BTK表达变化 ×400免疫组化检测各组肾小球及肾小管间质中CD68、BTK及p-BTK表达变化；与对照组比较：*P<0.05

2.4 各组肾组织CD68与iNOS、p-BTK共表达

激光共聚焦结果显示，与对照组相比，DN组肾脏内巨噬细胞浸润增加，并且巨噬细胞内iNOS与p-BTK表达增加，提示DN肾脏中巨噬细胞激活，并且BTK磷酸化参与了该过程。见图3。

图3 DN组肾组织中CD68与iNOS、p-BTK共表达 ×400

2.5 DN组肾脏BTK表达与临床指标的相关性分析

该实验将年龄、性别、糖化血红蛋白、SBP、DBP、MAP及血尿酸作为控制因素，分别对肾小球及肾小管间质内BTK表达与24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐及血尿素氮进行线性相关分析。结果显示，DN组肾小球BTK表达与24 h尿蛋白(

R

=0.511,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.339,

P

=0.026)呈正相关，与eGFR呈负相关(

R

=-0.386,

P

=0.011)，肾小球内BTK表达与血尿素氮无明显相关性(

R

=0.191,

P

=0.220)；同时，肾小管间质内BTK表达与24 h尿蛋白(

R

=0.550,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.453,

P

=0.002)及血尿素氮(

R

=0.355,

P

=0.019)也呈正相关，与eGFR呈负相关(

R

=-0.451,

P

=0.002)，提示肾脏内BTK的表达与DN患者的临床指标具有显著的相关性。见图4。

图4 DN组肾小球及肾小管间质中BTK表达与24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐、血尿素氮相关性分析

2.6 DN组肾脏p-BTK表达与临床指标的相关性分析

该实验对肾小球及肾小管间质内p-BTK的表达与24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐及血尿素氮进行线性相关分析。结果显示，DN组肾小球p-BTK表达与24 h尿蛋白(

R

=0.671,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.482,

P

=0.001)及血清尿素氮(

R

=0.421,

P

=0.004)均呈正相关，与eGFR呈负相关(

R

=-0.458,

P

=0.002)；同时，肾小管间质内p-BTK表达与24 h尿蛋白(

R

=0.552,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.455,

P

=0.002)及血尿素氮(

R

=0.359,

P

=0.017)也呈正相关，与eGFR呈负相关(

R

=-0.454,

P

=0.002)，提示肾脏内BTK的磷酸化激活与DN患者的临床指标同样具有很强的相关性。见图5。

图5 DN组肾小球及肾小管间质中p-BTK表达与24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐、血尿素氮相关性分析

3 讨论

随着社会的发展，糖尿病的患病率呈逐年上升的趋势。目前全球有4.15亿人患有糖尿病，估计有1.93亿人未诊断出糖尿病。2型糖尿病占糖尿病患者的90%以上，并且大约30%～40%的糖尿病患者会发展为肾病。DN给患者及社会都带来了严重的经济负担，因此，其预防与治疗成为目前亟需解决的难题。

DN的发病机制复杂，目前大多认为是由于机体的高血糖微环境导致代谢及血流动力学的紊乱引起了肾脏疾病，但随着研究的深入，大量研究表明炎症在DN的整个病程期间均起着重要作用，并决定着疾病的发展方向。高糖环境下可诱导多种炎症细胞(包括巨噬细胞、T细胞、肥大细胞)浸润，其中巨噬细胞在DN患者的肾脏活检组织和实验动物模型肾组织均有发现浸润，并且巨噬细胞浸润程度与肾损害的严重程度和纤维化程度相关。巨噬细胞可通过多种机制介导肾损伤，包括活性氧(ROS)、细胞因子和蛋白酶等的产生，这些损伤介质可以导致肾脏的炎症并最终引起纤维化改变。该研究表明，DN患者血清中促炎介质表达升高，并且DN患者肾组织中TNF-α表达增加，巨噬细胞浸润及激活增加。DN患者血清中的促炎趋化因子可以招募巨噬细胞进入肾脏，同时高糖环境可以诱导巨噬细胞的激活，引起肾脏内炎症的增加进而参与疾病的进展。

Bruton酪氨酸激酶(BTK)是Tec胞质酪氨酸激酶家族的成员，主要在髓系造血细胞中表达。除了其在B细胞中的重要调控作用外，BTK还参与调节巨噬细胞活化和促炎性细胞因子产生的Toll样受体(TLR)信号通路，而后者在DN的进展中起着重要作用。课题组前期研究表明，高糖可以激活骨髓来源的巨噬细胞中BTK表达，并且通过激活下游的NF-κB 信号通路，进而诱导促炎介质的释放，而BTK抑制后可以减轻该过程。该研究结果显示，DN患者肾组织中BTK的表达与激活增加，并且免疫荧光共标结果显示，BTK可以在巨噬细胞中激活。通过进一步的数据分析，研究表明DN组肾组织中肾小球和肾小管内BTK及p-BTK的表达均与24 h尿蛋白和血清肌酐呈正相关，与肾小球滤过率呈负相关，并且肾小管间质中的BTK表达与血尿素氮呈正相关，肾小球及肾小管间质中p-BTK的表达均与血尿素氮呈正相关。这提示BTK介导的炎症反应在DN的疾病进程中有着重要的作用，BTK可以作为DN的潜在治疗靶点。

DN目前缺乏有效的治疗手段，而减轻肾组织的炎症对于延缓疾病的进程有着重要的作用。该研究表明DN患者微循环和肾脏内炎症的增加，并且该过程与巨噬细胞和BTK的激活有着重要的联系。BTK的表达与DN患者的临床指标有着重要的相关性。该研究具有重要的临床意义且可能为DN的治疗提供了新的思路。