m6A去甲基酶FTO促进HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗耐药

纪琳娣，徐婷娟，殷 梧，程 民，吴新春，卞 庚，程联胜，胡世莲，沈国栋

乳腺癌高居女性恶性肿瘤发病率的首位，严重危害健康。自从曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)用于人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)阳性乳腺癌治疗以来，患者获益良多；但经临床广泛应用显示约半数HER2阳性乳腺癌病例会出现耐药现象，导致肿瘤进展或复发。 N6-甲基腺嘌呤(mA)甲基化是一种广泛发生于哺乳动物RNA的表观遗传学修饰方式，脂肪量与肥胖相关基因(FTO)是其中一种mA去甲基酶，参与个体发育及肿瘤发生发展等生理病理进程。该研究旨在探讨FTO与HER2阳性乳腺癌对曲妥珠单抗治疗抵抗的相关性，并探索自主研制的新型抗HER2人源化A21抗体(HuA21)对耐药性乳腺癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人乳腺癌细胞株BT474购自中国科学院细胞库，曲妥珠单抗购自罗氏旗下Genentech公司；甲氯芬那酸乙酯(MA2)由中国科学院上海药物研究所杨财广教授赠送；HuA21购自合肥瀚科迈博生物技术有限公司；胎牛血清(FBS) 购自美国CLARK Bioscience公司；RPMI 1640培养基购自武汉赛维尔公司；CCK-8试剂盒购自南京诺唯赞公司；Ki67免疫荧光抗体、鼠抗人FTO与METTL3抗体、兔抗人β-actin抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG购自美国CST公司；RNA提取试剂盒购自德国Analytik Jena公司；荧光定量PCR试剂盒及逆转录试剂盒购自北京全式金生物技术公司。

1.2 方法

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曲妥珠单抗耐药细胞株制备 参考Ding et al方法采用体外间接梯度法诱导耐药株，当细胞可以在80 μg/ml药物浓度下稳定生长时认定为曲妥珠单抗耐药株(BT474/TR)，将其用于后续实验。

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细胞处理与形态观察 取对数生长期的BT474细胞，加入10 μg/ml曲妥珠单抗，分别处理0、4、8 d；BT474/TR被10 μg/ml曲妥珠单抗处理8 d，用于后续实验，分别在荧光显微镜下观察曲妥珠单抗处理前后的细胞形态学变化。

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免疫荧光检测 药物处理后的细胞爬片，预冷PBS清洗，经4%多聚甲醛固定、 0.5% TritonX-100室温通透，封闭、清洗、4 ℃过夜孵育荧光一抗Ki67、PBS清洗、室温避光孵育荧光二抗、DAPI染核、滴加抗淬灭液后拍照，使用Image-Pro Plus 6.0软件对荧光值进行量化分析。

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细胞周期分析 药物处理后的细胞制备成单细胞悬液，70%乙醇固定细胞形态， 4 ℃过夜。离心去除乙醇，清洗后向每管细胞沉淀加入500 μl配置好的CCAA溶液(含PI染液50 μg/ml与核糖核酸酶100 μg/ml)，室温避光孵育30 min后使用安捷伦NovoCyte流式细胞仪检测细胞周期。

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qPCR检测 提取细胞内总RNA后进行qPCR实验，采用2的计算方式来表示基因的相对表达量。以GAPDH为内参，内参及目的蛋白引物序列见表1。

表1 qPCR引物名称与序列

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Western blot实验 收集细胞沉淀、裂解、离心、取上清液，BCA法进行蛋白定量，水浴锅内100 ℃煮10 min使蛋白充分变性。继续进行上样、跑胶、转膜、封闭等步骤，以人抗兔β-actin作为一抗内参，分别以人抗鼠的FTO、METTL3作为目的蛋白一抗，4 ℃孵育过夜,室温孵育二抗1 h后进行化学显影，应用Imagine J软件对蛋白条带进行灰度值测定。

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CCK-8细胞增殖检测 在96孔板每孔铺入适量细胞，培养72 h后弃去培养基，每孔加入100 μl新鲜培养基和10 μl CCK-8试剂，450 nm波长测吸光度。

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8

药物处理 分别以0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L浓度梯度的MA2预先处理BT474/TR 48 h，更换不含MA2的新鲜培养基继续培养72 h后进行CCK-8实验，选取对细胞生长促进作用最强的浓度进行后续实验。BT474/TR细胞分别分为Control组(对照组)、Tra组(10 μg/ml曲妥珠单抗处理72 h)、HuA21组(10 μg/ml HuA21处理72 h)、MA2+Tra组(40 μmol/L的MA2预处理48 h后10 μg/ml的曲妥珠单抗处理72 h)、MA2+Tra+HuA21组(40 μmol/L的MA2预处理48 h后10 μg/ml的曲妥珠单抗和10 μg/ml HuA21联合处理72 h)行CCK-8实验。

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mA甲基化检测 使用mA甲基化测定试剂盒方法检测HER2过表达的人乳腺癌细胞株BT474经曲妥珠单抗处理0、2、4 d和自行制备的曲妥珠单抗耐药株BT474/TR的mA水平。

2 结果

2.1 BT474/TR细胞形态变化、细胞增殖速度比较

比较BT474和BT474/TR细胞的形态变化，如图1所示，两种细胞均表现为聚团生长，形态舒展饱满，边缘规则。曲妥珠单抗处理后，BT474/TR形态无明显变化，但BT474细胞数目减少，胞体皱缩渐变成圆形，边缘不规则，伪足消失。CCK-8实验提示BT474组与同时间点的BT474+Tra组、BT474/TR组和BT474/TR+Tra组相比细胞增殖速度减慢(

F

=27.21，

P

<0.05)。经曲妥珠单抗处理0、4、8 d的BT474及BT474/TR，细胞增殖相关抗原Ki67表达比例逐渐减少(

F

=40.56，

P

<0.05，图2)，细胞周期内S期细胞比例依次降低(

F

=135.20，

P

<0.05，图3)。

图1 BT474和BT474/TR细胞形态和增殖速度比较 ×40

图2 免疫荧光检测细胞增殖因子Ki67变化 ×40

图3 流式检测细胞周期变化

2.2 耐药株BT474/TR去甲基酶FTO表达情况

BT474细胞在接受曲妥珠单抗处理至转变成曲妥珠单抗耐药株BT474/TR过程中mRNA的mA甲基化水平逐渐下降(

F

=109.59,

P

<0.05，图4)。生物信息学方法分析TCGA数据库显示，乳腺癌中Her2基因与METTL3、METTL14、METTL16、FTO、YTHDF1、YTHDF2基因表达之间存在相关性(图5)。qPCR和Western blot结果显示曲妥珠单抗处理4、8 d的BT474及经曲妥珠单抗处理8 d的BT474/TR相较于对照组，去甲基酶FTO表达量逐渐增加(

F

=71.48、100.36，

P

<0.05)，甲基转移酶METTL3表达量未见明显变化(图6)。

图4 m6A甲基化测定试剂盒检测RNA总m6A含量

图5 HER2与m6A甲基化相关酶表达之间的相关性分析

图6 qPCR和Western blot实验检测FTO和METTL3表达

2.3 MA2和HuA21联合作用可增强BT474/TR对曲妥珠单抗的敏感性

CCK-8检测不同浓度的FTO抑制剂MA2预处理对BT474/TR细胞促增殖作用，如图7所示，10 μmol/L浓度的MA2对BT474/TR细胞增殖作用最强(

F

=72.73，

P

<0.05)。经MA2预处理的BT474/TR对曲妥珠单抗的敏感性增加(

F

=164.90，

P

<0.05)，同时在MA2预处理的基础上联合使用曲妥珠单抗和HuA21较单独使用曲妥珠单抗对耐药株的抑生长作用更好(

F

=30.72，

P

<0.05)。

图7 HuA21与MA2减弱BT474/TR细胞对曲妥珠单抗的耐药性

3 讨论

针对人HER2阳性的乳腺癌类型，目前一线治疗方案是曲妥珠单抗联合化疗，但是一部分患者在接受曲妥珠单抗治疗初期显示无效或是在治疗期内逐渐产生耐药现象，使HER2阳性乳腺癌的治疗遭遇了瓶颈。研究报道HER2阳性乳腺癌对曲妥珠单抗的耐药机制主要有曲妥珠单抗同ErbB2受体的有效结合受阻、EGFR家族受体和IGF-IR等共表达以及PI3K-AKT信号通路的异常活化等方面，但尚无相关药物进入临床使用，迫切需要开展新的曲妥珠单抗耐药机制的研究。

已有研究表明肿瘤细胞处于休眠期或者静止期会对药物治疗产生抵抗。该研究中表明人乳腺癌HER2阳性细胞BT474在转变为曲妥珠单抗耐药株的过程中，细胞形态发生显著变化，细胞周期停顿在S期，细胞增殖相关因子Ki67表达下降，曲妥珠单抗对肿瘤细胞的增殖抑制作用减弱，提示耐药株处于一种生长增殖不活跃的休眠状态，改变耐药株的这种休眠状态，恢复对曲妥珠单抗的敏感性是解决BT474/TR耐药性问题的关键。近年来大量的研究证实mA甲基化在肿瘤发生发展与化疗耐药等方面发挥着重要的作用，该研究表明，敏感细胞株BT474在接受曲妥珠单抗处理至转变成曲妥珠单抗耐药株BT474/TR过程中，总mRNA的mA甲基化水平逐渐下降，去甲基酶FTO表达量逐渐增加，甲基转移酶METTL3表达量未见明显变化。使用去甲基酶FTO抑制剂MA2抑制BT474/TR细胞FTO蛋白活性后，结果显示耐药株对曲妥珠单抗的敏感性增加。

HuA21是该课题组自主研制的一种新型抗HER2人源化单克隆抗体，识别的是HER2胞外域的Ⅰ区的识别表位，有别于曲妥珠单抗结合胞外域的Ⅳ区的表位，这就为曲妥珠单抗和HuA21联合使用增强对肿瘤细胞的杀伤作用提供了结构基础，在应用FTO抑制剂MA2预处理以增加耐药株BT474/TR的mA甲基化程度基础上联合使用抗HER2抗体HuA21和曲妥珠单抗可加强对肿瘤细胞的杀伤作用。

综上所述，抑制人乳腺癌HER2阳性耐曲妥珠单抗细胞BT474/TR的去甲基酶FTO活性，增加mA甲基化程度，可改善BT474/TR对曲妥珠单抗的耐药作用，联合使用抗HER2抗体HuA21和曲妥珠单抗可加强对肿瘤细胞的杀伤作用。