轴突导向因子G1在肝细胞癌患者血清和组织中的表达及其临床意义

高星 叶甲舟 朴雪岷 李永强 林燕 梁嵘

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院1化疗一科，2肝胆胰外科

肝细胞癌是全球第六大常见癌症，也是导致癌症患者死亡的第三大主要原因[1]。早期肝细胞癌经过规范治疗后，5年生存率可达60%～80%。然而肝细胞癌起病隐匿，约2/3的患者初诊时已达临床晚期，无法手术，生存期往往不足1年[2]。目前肝细胞癌筛查主要还是依赖血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）检测，但临床上有近1/3的患者AFP阴性；而且急性病毒肝炎活动期及胃癌等疾病也常出现AFP升高。因此，寻找新的早期肝细胞癌标志物尤为重要。

轴突导向因子G1（netrin-G1，NTNG1）位于1号染色体1p13.3区，编码539个氨基酸，由10个外显子组成，大小约为60.5 kDa，属于神经突起生长导向因子Netrins家族的一员[3]。NTNG1最早于2000年在小鼠的中脑和后脑中被发现，属于Netrin家族中的膜结合蛋白型，在其C末端具有糖基磷脂酰基醇锚（glycosylphosphatidylinositol，GPI），通过结合GPI实现与细胞膜结合[4]。生理状态下，NTNG1主要在脑组织表达，在轴突导向具有重要作用，在肿瘤发生发展中也起重要的调控作用。目前NTNG1已被发现在胰腺、肺和乳腺等多脏器中表达，并调节多种生理过程，如细胞介导、黏附、迁移和血管生成等[5-6]。HAO等[7]基于数据挖掘和深层生物学信息分析发现，NTNG1在肺腺癌低表达，而在肺鳞状细胞癌中高表达，但均与较差的生存率呈正相关。FRANCESCONE等[8]也报道NTNG1在胰腺癌组织中高表达，而与生存时间呈负相关；在裸鼠体内敲低NTNG1表达后成瘤能力削弱。然而，NTNG1与肝细胞癌的关系鲜见报道。本研究通过检测NTNG1在肝细胞癌患者血清及其组织中的表达，并分析其临床意义，以期寻找新的肝细胞癌标志物和治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2019年7月至2019年10月本院收治的26例肝细胞癌患者，以及同期于本院门诊就诊的4例肝炎患者、19名健康受试者、41例其他肿瘤患者（结直肠癌14例，卵巢癌10例，胰腺癌10例，膀胱癌7例）血清，平均年龄（52.02±13.30）岁，男性63例，女性27例。纳入标准：⑴肝癌患者均经术后病理诊断均为肝细胞癌，术前未经化疗、放疗及靶向治疗；⑵肝炎患者符合乙型病毒性肝炎诊断标准；⑶健康受试者肝功能生化指标正常；⑷其他恶性肿瘤患者均经术后病理学检查明确诊断。排除标准：血清标本溶血、脂血。所有研究对象均签署知情同意书。

收集2018年7月至2019年12月本院手术切除的63例肝细胞癌组织及其相应邻近癌旁组织（距离癌组织2 cm以上）。纳入标准：⑴初治且接受肝切除术治疗；⑵经术后病理诊断为肝细胞癌，无其他恶性肿瘤疾病史；⑶术前均未接受化疗、放疗或靶向治疗。排除标准：⑴因肝细胞癌破裂出血行急诊手术者；⑵病历资料不完整或围手术期死亡者；⑶随访时间＜3个月者；⑷合并严重心、肺、肝、肾、脑等疾病者。本研究方案经广西医科大学附属肿瘤医院伦理与研究委员会批准，获得患者书面知情同意。

1.2 资料收集与随访

查阅病历收集患者性别、年龄、饮酒史、吸烟史以及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染情况、BCLC分期、TNM分期、HBsAg、AFP、病理性微卫星灶、微血管侵犯、肿瘤大小、肿瘤数目、是否合并肝硬化、有无癌栓等临床资料。出院后2年内每3个月电话随访1次，之后每6个月随访1次，随访截至2021年7月2日。研究终点为总生存期（overall survival，OS），OS定义为手术日至患者死亡或末次随访的时间。失访或末次随访仍未死亡的病例作为截尾事件。

1.3 ELISA法检测血清中NTNG1的表达

抽取患者清晨空腹静脉血10 mL，室温凝集30 min，4 000× g离心20 min后，所得血清置于-80℃冰箱保存、备用。将试剂DLCN20（美国R&D公司）复温，每孔中加入100 μL稀释液后，分别放入等量的标准品和实验血清样品，4℃孵育2 h，加入200 μL偶联试剂，4℃孵育2 h，用洗涤液清洗后加入200 μL底物溶液，室温孵育30 min后加入终止液，检测波长450 nm处的吸光度（OD）值。通过标准样品计算血清中NTNG1的浓度。

1.4 Western blot实验检测组织中NTNG1的表达

分别取100 mg新鲜肝细胞癌及癌旁组织，加入RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司）提取组织蛋白，严格按照BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）说明书操作检测蛋白浓度。每孔加入30～50 μg标准化蛋白样品，在加满Tris-Glycine电泳液的垂直电泳槽内，浓缩胶在80 V恒压下电泳至分离胶界面时，调至120 V继续电泳至溴酚蓝分离胶底部。转移至聚PVDF膜，加入一抗NTNG1（ab153834，1∶1 500）4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入二抗（ab205719，1∶10 000）室温孵育1 h；取出PVDF膜，洗膜后滴加ECL工作液反应 2～5 min；于暗室内压片、显像。以Image J软件检测条带灰度值，以目标条带灰度值与β-actin（ab179467，1∶5 000）条带灰度值的比值代表各组织中NTNG1蛋白表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件分析实验数据，使用GraphPad Prism 8.0对实验数据进行图形处理。计量资料若符合正态分布，则采用独立样本t检检，以均数±标准差表示；若不符合正态分布，采用中位数（上、下四分位数）表示。采用配对设计的Wilcoxon符号秩检验比较肝细胞癌组织及其癌旁正常组织中NTNG1蛋白表达水平的差异，并采用χ2检验NTNG1蛋白与临床病理参数间的关系。用Kaplan-Meier法计算总生存率并绘制生存曲线，组间差异比较采用Log-rank检验。采用单因素Cox回归分析影响患者OS的相关因素，将差异有统计学意义的因素纳入多因素Cox回归模型。血清中NTNG1表达水平不符合正态分布，首先采用Kruskal-Wallis H检验，组间差异有统计学意义，继而进行Bonferroni检验。诊断试验的评价采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并根据约登指数的最大值确定最佳临界值。以双侧P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NTNG1在肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达

Western blot检测结果显示，NTNG1蛋白在肝细胞癌组织和癌旁组织中均有不同程度表达，见图1A。NTNG1蛋白在肝细胞癌组织的平均表达量为1.0164，在癌旁组织中为0.6088，肝细胞癌组织中NTNG1蛋白表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（Z=-3.374，P=0.001），见图1B。结果说明NTNG1蛋白在肝细胞癌组织中呈现高表达。

图1 63例肝细胞癌患者癌组织及其癌旁组织中NTNG1蛋白的表达Fig.1 Expression of NTNG1 protein in carcinoma and adjacent tissues of 63 patients with hepatocellular carcinoma

2.2 NTNG1蛋白表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征的关系

肝细胞癌组织中NTNG1表达与患者年龄、门脉高压、腹水、AFP、白细胞水平、总胆红素水平、包膜侵犯及微血管密度相关（均P＜0.05）；与性别、BCLC分期、分化程度等无关（均P＞0.05）。见表1。

表1 NTNG1表达与63例肝细胞癌患者临床病理特征的相关性Tab.1 Correlation between NTNG1 protein expression and the clinicopathological characteristics in 63 hepatocellular carcinoma patients

2.3 NTNG1表达水平与肝细胞癌患者OS的关系

63例患者随访截至2021年7月，中位随访22个月（范围：2～27个月），其中死亡17例。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验结果显示，NTNG1低表达组的总生存率高于NTNG1高表达组（χ2=6.715，P=0.010）。见图2。

图2 NTNG1高表达与低表达肝细胞癌患者的生存曲线Fig.2 Survival curves of hepatocellular carcinoma patients with high and low expression of NTNG1

2.4 影响肝细胞癌患者预后的单因素和多因素分析

单因素分析结果显示，性别、BCLC分期、TNM分期、肿瘤大小、NTNG1表达水平与预后相关（均P＜0.05）。

多因素分析结果显示，NTNG1高表达是肝细胞癌患者术后预后不良的独立危险因素（HR=3.715，95%CI=1.207～11.439，P=0.022），男性是肝细胞癌患者术后预后不良的独立保护因素（HR=0.180，95%CI=0.057～0.563，P=0.003）。见表2。

表2 Cox回归分析影响肝细胞癌患者术后总生存期的因素Tab.2 Cox analysis of factors affecting postoperative overall survival in hepatocellular carcinoma patients

2.5 肝细胞癌患者及各对照组患者血清中NTNG1表达水平

ELISA法检测结果显示，肝细胞癌患者血清中NTNG1的表达水平高于健康受试者（P＜0.0001），也明显高于其他肿瘤患者（P＜0.0001），见图3。

图3 NTNG1在肝细胞癌患者及各对照组患者血清中的表达情况Fig.3 Expression levels of NTNG1 in serum of patients with hepatocellular carcinoma and each control group

2.6 血清NTNG1在肝细胞癌中的诊断价值

采用ROC曲线评估肝细胞癌患者以及对照组（包括肝炎患者、健康受试者、其他肿瘤患者）共90例受试者血清NTNG1的诊断价值，绘制肝细胞癌区别于非肝细胞癌患者的ROC曲线，当NTNG1以69.50 pg/mL为临界值时，诊断肝细胞癌的灵敏度和特异度达到最佳，分别为84.62%和76.56%，ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为 0.8251（95%CI：0.7298～0.9205，P＜0.0001），见图4。

图4 肝细胞癌患者血清NTNG1的ROC曲线Fig.4 The ROC curve of NTNG1 in serum of patients with hepatocellular carcinoma

3 讨论

肝细胞癌的发生是一个多步骤、多因素的过程，包含一系列抑癌基因失活和癌基因异常激活[9]。肝细胞癌发展过程中，多种与细胞增殖、迁移和转移密切相关的分子信号发生异常表达或激活，这决定了肝细胞癌高复发、高转移的生物学特点，进一步导致患者预后不良。因此，深入探索肝细胞癌发生发展相关基因，对开发肝细胞癌新的诊断、药物标靶和预后标志物具有重要意义。

Netrins作为一类自分泌蛋白或膜结合蛋白，可以通过结合不同类型受体发挥不同作用。最初Netrins在中枢神经系统发展中起重要作用，包括调节神经细胞的迁移、分化和凋亡，并稳定血脑屏障，限制免疫细胞进入中枢神经系统[10]。此外，Netrins也参与一些非神经组织的黏附、迁移和分化等生理过程，如血管生成、淋巴管形成和炎症等[11]。现有研究也显示，Netrins参与调控肿瘤的发生与发展，在不同类型肿瘤中发挥抑制或促进作用[12]。如有研究报道NTN1在膀胱癌[13]、胃癌[14]、非小细胞肺癌[15]等多种恶性肿瘤中表达异常升高。然而，在早期胰腺癌组织中NTN1呈低表达，并通过下调MEK/ERK通路和抑制整合素β4（ITGB4）表达而抑制早期胰腺癌细胞生长[16]。NTNG1作为Netrins家族的新兴角色，同样发挥类似功能[7]。有研究报道在结肠癌中，NTNG1高表达患者发生DNA甲基化的频率增加，且与患者预后不良相关[17]。而在无蒂锯齿状腺瘤/息肉（SSA/P）和锯齿状腺瘤标本中，ANDREW等[18]研究发现NTNG1的甲基化区域存在差异性，采用甲基化特异性聚合酶链反应检测其甲基化状态，有助于描述SSA/P的生物学特性，成为患者鉴定和监测指标。本研究检测NTNG1蛋白在肝细胞癌中的表达，发现与癌旁组织相比，NTNG1在肝细胞癌组织中显著高表达，且与患者年龄、门脉高压、腹水、AFP、白细胞水平、总胆红素水平、肿瘤包膜及微血管密度等不良特征相关，生存分析也显示NTNG1高表达患者预后不良，进一步行Cox回归分析证实NTNG1高表达是预后不良的独立危险因素，说明NTNG1可能参与肝细胞癌发生并在其中发挥促癌作用。

相对于肝组织标本，血清检测具有创伤性小、操作简便等优点，也更利于临床推广。为此，本研究采集了门诊就诊的肝细胞癌患者以及对照患者包括肝炎患者、健康受试者、其他肿瘤患者等共90例受试者血清，结果所有受试者均能检测到NTNG1表达，且肝细胞癌患者血清中NTNG1的表达水平明显高于健康受试者及其他肿瘤患者，与其在肝细胞癌组织中的表达类似；此外ROC曲线分析显示，NTNG1诊断肝细胞癌的AUC为0.8251，灵敏度和特异度分别为84.62%和76.56%，说明NTNG1在肝细胞癌中的表达具有一定特异性，且诊断效能良好，可能是潜在的肝细胞癌早期诊断标志物。

综上所述，NTNG1在肝细胞癌患者组织及血清中呈高表达，且NTNG1高表达是预后不良的独立危险因素，血清NTNG1对肝细胞癌患者也具有良好的诊断效能，因此NTNG1可能是肝细胞癌患者潜在的早期诊断及预后评估指标。但本研究为单中心小样本分析，NTNG1在肝细胞癌中的作用仍需进一步研究验证。