白细胞介素-33对急性髓系白血病细胞株HL-60、NB4凋亡和周期的调控作用及机制研究

陈雪欣 王一倩

作者单位：511436 广州 广州医科大学-广州生物院联合生科院

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类起源于髓系造血干/祖细胞的恶性克隆性血液系统疾病，约占所有成人白血病病例的31%[1-3]。目前AML的临床治疗措施主要为阿糖胞苷联合蒽环类抗生素的“3+7”强化诱导化疗以及异基因造血干细胞移植，但是临床完全缓解后仍有一半的患者复发[4-5]。因此，探索AML发展分子机制，寻找更有效的治疗方案尤为重要。白细胞介素-33（interleukin 33，IL-33）是在2005年发现的一种前炎症细胞因子，可通过与受体白细胞介素1受体样分子1（interleukin-1 receptor like-1，IL1RL1）结合，参与多种炎症与免疫反应过程[6]。在BCR-ABL表达的慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）细胞中，IL-33/IL1RL1通过激活STAT5信号通路而阻断甲磺酸伊马替尼对CD34+祖细胞的抗增殖作用[7]。此外，有研究发现IL-33通过MYD88/IRAK4促进骨髓增生性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）的骨髓细胞增生异常[8]。而在嗜碱性白血病中（acute basophilic leukemia，ABL）中，IL-33参与MYB-GATA1融合基因调控的CD34+原代细胞的嗜碱性分化[9]。本团队前期研究证实IL1RL1在inv（16）AML细胞表面高度表达，且外源性IL-33的加入能促进AML细胞株ME-1的存活，通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）可抑制原代小鼠以及AML患者细胞凋亡[10-12]。本研究在此基础上，进一步探索IL-33/IL1RL1通路对AML细胞凋亡和细胞周期的影响及其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

人AML细胞系HL-60、NB4均购自美国模式培养物集存库ATCC中心（ATCC）；RPMI-1640培养基购自美国ATCC生物生物标准品资源中心；胎牛血清、Pen Strep均购自美国Gibco公司；细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；HRP标记的山羊抗兔二抗购自成都正能生物；HRP标记的兔抗鼠二抗购自南京巴傲德生物科技有限公司；周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinases 1，CDK1）抗体（货号CY516-50）、GAPDH抗体（货号12231P）均购自Abways公司；p-p38 MAPK抗体（货号YP0338）、p38 MAPK抗体（货号YT3513）均购自美国ImmunoWay公司；蛋白酶抑制剂混合液（货号P6730）购自索莱宝公司；磷酸酶抑制剂（货号KGP602）购自凯基公司；IL-33（货号10368-HNAE）购自北京义翘神州科技股份有限公司；p38 MAPK特异性抑制剂SB203580（货号HY-10256）购自MCE公司；离心机购自北京时代北利离心机有限公司；流式细胞仪CytoFLEX购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 将HL-60、NB4细胞接种至含20%FBS和2%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养。收集对数生长期的HL-60、NB4细胞，以每孔5×105个细胞均匀接种于24孔板或96孔板中培养，并分为对照组（等体积PBS）、IL-33组、SB+IL-33组，其中IL-33组添加100 ng/mL IL-33处理72 h，SB+IL-33组添加10 μmol/L SB203580预处理1 h后，再采用100 ng/mL IL-33处理72 h。处理结束后收集备用。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 各组处理好的细胞用PBS洗涤后，再用95 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，并调节细胞密度至1×106/mL，加入5 μL Annexin V-FITC染液，混匀，冰上避光孵育30 min，再向每管加入5 μL DAPI和200 μL 1×Binding Buffer，混匀。使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，并用CytExpert 2.0进行流式数据分析。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 各组处理好的细胞经PBS洗涤后，用冷乙醇固定12 h以上，用PBS洗涤，离心，弃去乙醇，加入RNase，37℃水浴30 min，再加入PI溶液冰上避光孵育30 min，置于流式细胞仪检测细胞周期，用Modfit 5.0软件分析细胞周期FACS数据。

1.2.4 Western blot检测蛋白的表达水平 向各组处理好的细胞中加入RIPA细胞裂解液和磷酸酶抑制剂以及蛋白酶抑制剂，15 000 r/min离心30 min，取上清（即蛋白溶液），用BCA定量试剂盒进行蛋白定量。取适量体积的蛋白加入上样缓冲液，加热使蛋白变性后，进行电泳、转膜，再用5%脱脂奶室温封闭1 h，加入一抗（CDK1、p-p38 MAPK、p38、GAPDH抗体），4℃孵育过夜；次日用相应的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤后，滴加显影液进行检测，使用Image J软件进行灰度分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示。多组均数比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，采用Bonferroni检验进行多重比较。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外源性IL-33抑制HL-60和NB4细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，与对照组细胞相比，HL-60和NB4细胞经IL-33作用72 h后，细胞凋亡水平均降低（P＜0.001；P=0.013）；而SB+IL-33组细胞经SB203580和IL-33联合处理后，细胞凋亡水平均高于IL-33组（P=0.003；P=0.023），见图1。说明IL-33可能通过激活p38 MAPK抑制AML细胞凋亡。

图1 外源性IL-33对HL-60和NB4细胞凋亡的影响Fig.1 Effects of exogenous IL-33 on apoptosis of HL-60 and NB4 cells

2.2 外源性IL-33对HL-60和NB4细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示，与对照组细胞相比，IL-33作用HL-60和NB4细胞72 h后，两株细胞的S期细胞比例均显著升高（均P＜0.001）；与IL-33组相比，经SB203580和IL-33联合处理72 h后，SB+IL-33组细胞的S期细胞比例均显著降低（P=0.004；P=0.016）,见图2。说明IL-33能有效促进AML细胞增殖，而抑制p38 MAPK激活可逆转IL-33的促增殖作用。

图2 外源性IL-33对HL-60和NB4细胞周期的影响Fig.2 Effects of exogenous IL-33 on cell cycle of HL-60 and NB4 cells

2.3 外源性IL-33诱导HL-60和NB4细胞周期相关蛋白CDK1的表达

Western blot检测p38 MAPK通路蛋白和周期相关蛋白CDK1的表达，结果显示，与对照组细胞相比，IL-33组p-p38MAPK和CDK1表达水平显著增高（HL-60：P=0.022，P=0.002；NB4：P=0.009，P=0.013），而SB+IL-33组p-p38 MAPK和CDK1的表达水平较IL-33组明显降低（HL-60：P=0.027，P＜0.001；NB4：P=0.008，P=0.017），见图3。表明IL-33通过p38 MAPK通路促进AML细胞增殖，进而促进疾病发展。

图3 外源性IL-33对HL-60和NB4细胞周期相关蛋白表达的影响Fig.3 Effects of exogenous IL-33 on expression level of cell cycle-related protein in HL-60 and NB4 cells

3 讨论

AML具有高度异质性，易复发，且治疗效果差，预后不良。目前AML总体生存率达65%以上，但是不同亚型患者的生存率存在显著差异性[13-14]。因此，探索新的AML治疗靶点对进一步改善患者存活率极为重要。IL-33为IL-1超家族的新成员，其受体为IL1RL1，主要参与调节机体免疫和炎症反应[15-16]。IL1RL1已被发现高度表达于原代AML患者细胞以及伴inv（16）AML原代小鼠细胞，并且能通过激活p38 MAPK有效抑制细胞凋亡[11-12]。还有研究报道，p38 MAPK信号通路能调控多种机体炎症反应，参与细胞存活以及信号传导[17-18]。上述研究表明，IL-33/IL1RL1通路可能是AML新的潜在治疗靶点，因此本研究利用两种不同亚型AML细胞株HL-60以及NB4进一步探究IL-33/IL1RL1通路通过介导p38 MAPK维持细胞存活的机制。

本研究结果显示，HL-60、NB4细胞经外源性IL-33处理后凋亡率均显著降低，而经p38 MAPK特异性抑制剂SB203580和IL-33联合处理后细胞凋亡率较IL-33组显著升高，提示IL-33/IL1RL1信号可能通过激活p38 MAPK通路抑制细胞线粒体凋亡通路，从而降低HL-60和NB4细胞的凋亡能力。本研究还发现，与对照组相比，IL-33组的S期细胞比例和p-p38 MAPK、CDK1的表达水平均显著增加，而SB203580和IL-33联合处理后S期细胞比例和p-p38 MAPK、CDK1的表达水平均较IL-33组显著降低，提示IL-33可能通过磷酸化p38 MAPK而促进CDK1表达，从而影响细胞周期进程。实际上，本研究发现加入外源性IL-33后，相较于NB4细胞，HL-60细胞中CDK1表达水平增加更明显，说明HL-60细胞对IL-33的作用更敏感，提示不同亚型AML细胞在体外对IL-33的敏感性不同，这为将来探究IL-33/IL1RL1通路对不同亚型AML发展的作用机制提供理论依据。

肿瘤微环境主要指肿瘤细胞包括肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关纤维细胞、肥大细胞等赖以生存的复杂环境，而这些细胞参与了肿瘤细胞的生长、存活和耐药性[19]，也能分泌多种细胞因子以及趋化因子促进肿瘤转移。除此之外，失调的细胞因子网络在很大程度上影响肿瘤微环境，从而影响肿瘤发展。在AML中，骨髓（bone marrow，BM）微环境的稳定对促进白血病发展十分重要。已有研究报告了BM微环境在AML发生发展中的作用机制[20-21]。然而，BM中的细胞因子与白血病细胞活性之间的关系尚不完全清楚。IL-33属于IL-1细胞因子家族，参与多种生物学活动，包括炎症、免疫反应和感染过程[6]。有研究报道，外源性IL-33的加入能有效促进CML细胞增殖，同时促进AML细胞耐药的产生[7]。本研究通过利用不同AML细胞株，同样发现AML细胞可能借助BM微环境中的IL-33激活IL1RL1受体，从而调节下游蛋白活性，最终抑制AML细胞凋亡。但是既往研究也显示，IL-33可能激活除p38以外的信号通路，包括NF-κB以及ERK等[6]。因此，IL-33/IL1RL1轴发挥作用的具体机制仍有待进一步探索。

综上所述，本研究发现在不同亚型AML细胞株中，外源性IL-33的加入能有效降低细胞凋亡率，阻止细胞周期阻滞，而IL-33可能通过磷酸化p38 MAPK而促进CDK1表达，从而影响细胞周期进程。因此，IL33/IL1RL1信号通路可能是AML治疗的新靶点，这为AML治疗提供了新的思路。