长白山地区地梢瓜有效成分制备及抗炎、镇痛作用研究

王 珊，林昱芷，卢学春，仲怀宇，孙佳慧，安丽萍，杜培革，孙晶波

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.中国人民解放军总医院，北京 100853)

地梢瓜(Cynanchumthesioides(Freyn).K.Schum.)为萝摩科鹅绒藤属多年生草本植物，其全草及果实均可入药.《蒙药正典》最早记载的是果实入药，其具有清腑热、止泻之功效.《河南中草药手册》及《现代本草纲目》记载地梢瓜具有补肺气、清热降火、生津止渴、消炎止痛等功效[1].通过文献检索，仅有针对其基本成分结构鉴定[2-3]及地梢瓜苷活性的研究[4-7]，尚未见其抗炎、镇痛等药理作用的相关研究.因此，本研究对长白山地区地梢瓜的抗炎、镇痛活性成分进行提取、纯化，进一步通过体内试验探索其作用机制，为地梢瓜有效部位的开发应用提供参考.

1 仪器与材料

ICR雄性小鼠(长春市亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK (吉)-2016-0003)；植物样品(吉林省长白山地区)经吉林市食品药品检验所金英兰教授鉴定为萝摩科植物地梢瓜.

UV-2550型紫外分光光度计(岛津公司，日本)；Infinite M200型全波长多功能酶标仪(NanoQuant公司，瑞士)；YLS-6B型智能热板仪(上海精密仪器仪表有限公司)；齐墩果酸、芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)；AB-8 型大孔吸附树(沈阳鼎国生物试剂有限公司)；乙醇、醋酸等分析纯试剂(吉林市欣利化学试剂有限公司).

2 方 法

2.1 总三萜和总黄酮的提取及制备

取鲜地梢瓜果壳适量，加10倍量70%乙醇，回流提取3次，1.5 h/次，合并提取液，回收溶剂，蒸干，称重.将提取物加蒸馏水溶解制成浓度为2 mg/mL的溶液，选用AB-8型大孔吸附树脂湿法上柱，吸附2 h后依次以2倍柱体积的蒸馏水和25%乙醇洗脱，弃去洗脱液；再以5倍柱体积的80%乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥即得总三萜(total triterpenoids，TTP)[8].

取地梢瓜果壳适量，加20倍量石油醚回流提取1 h，过滤，滤渣挥干石油醚后再用碱性(pH=9)70%乙醇回流提取2次，1 h/次；合并提取液并调至中性(pH=7)，回收溶剂后以80%乙醇溶解，于4 ℃条件下静置24 h，过滤，将滤液浓缩、干燥，即得总黄酮(total flavonoids，TFN)[9].

2.2 总三萜和总黄酮的急性毒性研究

2.2.1 总三萜的急性毒性研究

取一定数目的小鼠进行预试验，确定其中总三萜组小鼠全部致死的最小剂量及小鼠全部成活的最大剂量，给药范围为20.24～11.28 g/kg.根据预试验结果，选取60只小鼠，雌雄各半，随机平均分为6组，给药组分别给药20.10、17.47、15.11、13.06、10.00 g/kg，对照组为等体积的生理盐水，试验前禁食不禁水8 h，按照设置剂量灌胃给药，观察7 d内各组小鼠死亡情况，结果用改进寇式法计算半数致死量(LD50)及其95%可信区间[10]：

logLD50=xm-i(∑P-0.5)，

其中：xm为最大剂量的对数；i为相邻前后两组剂量的对数差；∑P为各组死亡率的总和.均取以10为底的对数.

2.2.2 总黄酮的急性毒性研究

取一定数目的小鼠进行预试验，根据预试验结果，给药剂量的选取范围为54.64～25.28 g/kg.选取60只小鼠，雌雄各半，随机平均分为6组，给药组分别给药55.19、44.79、37.01、30.59、25.00 g/kg，给药方式及数据处理同2.2.1，计算LD50及其95%可信区间.

2.3 总三萜和总黄酮的抗炎作用

2.3.1 二甲苯致小鼠耳肿胀试验

将72只ICR雄性小鼠随机平均分为9组，空白对照组、模型组、阳性对照组、总三萜高、中、低剂量组(分别为132、66、33 mg/kg)和总黄酮高、中、低剂量组(分别为196、98、49 mg/kg).给药组按剂量连续灌胃给药7 d，模型组灌胃等体积生理盐水(0.1 mL/10 g)，阳性对照组和空白组不给药.给药组末次给药40 min、阳性对照组皮下注射25 mg/kg地塞米松40 min后，除空白对照组外，各组小鼠右耳正反两面均匀涂抹25 μL二甲苯致炎[11]，左耳做空白对照.

致炎1 h后，各组小鼠眼眶取血，5 000 r/min离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书步骤检测TNF-α和IL6含量.

将取血后的小鼠处死，剪下双耳，用自动打孔器于小鼠左右耳对称处打下耳片，称重并计算各组小鼠耳肿胀度和肿胀抑制率：

肿胀度(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg)，

2.3.2 蛋清溶液致小鼠足趾肿胀的试验

选用64只ICR雄性小鼠，随机平均分为8组，分组及给药与2.3.1相同，但无空白对照组.给药组末次给药60 min、阳性对照组皮下注射25 mg/kg地塞米松40 min后，于右后跖皮下注射1%蛋清溶液5 μL，注射3 h后测量各小鼠右后跖厚度，计算小鼠致炎前后的足肿胀度及抑制率[12-13]：

肿胀度(mm)=致炎后小鼠右后跖厚度(mm)-致炎前小鼠右后跖厚度(mm)，

2.3.3 智能热板致小鼠的热板疼痛性试验

将智能热板仪的温度调节到(60±5) ℃，分别测定给药前每只小鼠的正常痛阈值：以小鼠置于热板上开始舔跖后足或出现跳跃现象所需要的时间作为痛阈值[14]，共测3次，间隔40 min/次，取3次痛阈值的平均值作为该小鼠的给药前痛阈值.选取痛阈值在10～40 s的64只雄性ICR小鼠进行正式试验.分组及给药方法同2.3.2，分别测定末次给药后30、60、90、120 min各个小鼠的痛阈值.若小鼠超过1 min无反应，则将该小鼠取出.

2.3.4 醋酸致小鼠扭体试验

将64只ICR雄性小鼠随机分为8组，分组及给药方法同2.3.2.末次给药60 min后，给小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.15 mL，观察并记录小鼠腹腔注射冰醋酸溶液15 min内出现扭体反应的时间及次数，并计算其疼痛抑制率：

2.4 统计学分析

3 结果与分析

3.1 地梢瓜总三萜和总黄酮的急性毒性试验结果

根据改良寇氏法计算得总三萜的LD50为14.62 g/kg，95%可信区间为12.09～20.34 g/kg；总黄酮的LD50为23.39 g/kg，95%可信区间为20.53～28.31 g/kg.

3.2 地梢瓜总三萜和总黄酮对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

与模型组比较，不同剂量的地梢瓜总三萜和总黄酮均能减轻二甲苯所致小鼠右耳的红、肿等症状，且随着给药剂量的增加，抑制作用逐渐增强.其中，总三萜高剂量组和总黄酮中、高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，与低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.01)，但有减轻趋势.整体上，总黄酮抑制小鼠耳肿胀的效果相对优于总三萜.见表1.

表1 地梢瓜总三萜和总黄酮对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用Tab.1 Inhibitory effects of TTP and TFN of Cynanchum thesioides on xylene-induced ear swelling of mice

3.3 地梢瓜总三萜和总黄酮对蛋清致小鼠足趾肿胀的影响

与模型组比较，不同剂量的地梢瓜总三萜和总黄酮对蛋清所致小鼠足肿胀均有抑制作用，且随着给药剂量的增加，抑制作用逐渐增强，其中，高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01).整体上，总黄酮对蛋清溶液致小鼠足趾肿胀的作用效果相对优于总三萜.见表2.

表2 地梢瓜总三萜和总黄酮对蛋清溶液致小鼠足趾肿胀的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of TTP and TFN of Cynanchum thesioides on the toe swelling of mice induced by egg white solution inparagraph

3.4 地梢瓜总三萜和总黄酮对小鼠血清中炎症因子水平的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6含量均显著升高(P<0.01)，表明炎症模型建立成功.与模型组比较，总三萜和总黄酮给药组均能降低小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量，且随着给药剂量的增加其作用增强，高剂量组的作用明显(P<0.05)，整体上总黄酮降低炎症小鼠血清中TNF-α水平的作用更显著，而总三萜则降低IL-6水平的作用更强(低剂量组P<0.05，中、高剂量组P<0.01).总三萜高剂量组和总黄酮中、高剂量组小鼠血清TNF-α水平与空白组小鼠无显著性差异(P>0.01)，说明这3组药物均可使炎症小鼠血清TNF-α降至正常水平；而所有给药组小鼠血清IL-6水平与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，说明地梢瓜总三萜和总黄酮虽然可以降低炎症小鼠血清中IL-6的含量，但不能恢复至正常水平，地塞米松也无法使其降至正常水平(P<0.01).见表3.

表3 各组小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量Tab.3 Contents of TNF-α and IL-6 in serum of mice in each group

3.5 智能热板致小鼠的热板疼痛性试验

给药前各组间基础痛阈值比较差异无统计学意义(P>0.05).与模型组比较，各给药组均不同程度延长了小鼠的痛阈值，其中，总三萜和总黄酮高剂量组在给药后30 ～120 min的痛阈值均极显著延长，而且总黄酮高剂量组痛阈值较阳性对照组长，说明其具有较强的镇痛活性.见表4.

表4 地梢瓜总三萜和总黄酮对小鼠热板性疼痛的影响Tab.4 Effects of TTP and TFN of Cynanchum thesioides on hot plate pain in mice

3.6 醋酸致小鼠扭体试验

与模型组比较，不同剂量的地梢瓜总三萜和总黄酮均能减少醋酸所致小鼠扭体反应次数.其中，总三萜和总黄酮高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，其他给药组之间比较差异具有统计学意义(P<0.05)，表明这两种有效部位均有较好的镇痛作用.见表5.

表5 地梢瓜总三萜和总黄酮对醋酸致小鼠扭体反应的影响Tab.5 Effects of TTP and TNF of Cynanchum thesioides on the writhing response of mice induced by acetic acid

4 讨 论

地梢瓜中含有黄酮、三萜、甾体、酚酸[15]等化合物，有研究[16-17]表明：黄酮类化合物具有活血化瘀、保肝抗炎、抗病毒、抗辐射、抗菌等功效，三萜类化合物具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗菌、降低胆固醇等生理活性.因此，本研究以地梢瓜中的总黄酮、总三萜为对象，研究其提取纯化工艺、含量测定方法及抗炎镇痛活性.通过适宜的提取、纯化方法富集有效部分，其中地梢瓜总三萜含量为63.9%，总黄酮含量达到51.2%，表明地梢瓜中三萜和黄酮类化合物含量较高，采用本研究方法能很好富集.炎症反应为机体对损伤因子产生的防御性反应，常表现为红、肿、热、痛等症状[18]，是机体对有害刺激所产生的复杂的病理、生理反应[19]，这些反应受多种炎症因子和炎性介质的调控，存在于许多重大疾病的发生、发展过程中[20-21].疼痛是由高级中枢对伤害性刺激进行整合，伤害性刺激产生相应的主观体验，进而改变了大脑区域之间的信息流动和整合.当机体受到外界刺激或损伤时，会将其转化为伤害性信息，由伤害性传入通路再传入中枢神经系统[22]，从而产生痛觉.因此，抗炎、镇痛药物的研究是当前热门研究领域之一.

本研究在致炎试验中，使用二甲苯和1%蛋清致使小鼠产生炎症.在小鼠耳肿胀试验及足肿胀试验中观察到：不同剂量的总黄酮和总三萜对小鼠炎症均有较强的抑制作用，且随着给药剂量的增加，其抑制作用逐渐增强，总体上看，地梢瓜的总黄酮对小鼠炎症的抑制作用强于总三萜.检测小鼠血清中炎症因子水平的结果表明：总黄酮和总三萜均能降低小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量，且随着给药剂量的增加其作用也增强，表明地梢瓜总黄酮和总三萜的抗炎作用机制可能与其抑制血清中TNF-α和IL-6水平升高有关.在醋酸扭体试验中，不同剂量的总三萜和总黄酮对试验小鼠均有明显的镇痛作用，整体上总三萜的镇痛效果强于总黄酮.而在热板试验中，两种有效部位均能延长小鼠痛阈值，总黄酮的镇痛效果强于总三萜.两种试验结果均证实了总黄酮和总三萜的镇痛作用.

经文献检索，尚未发现有关地梢瓜中总黄酮和总三萜的研究报道.本研究对象为长白山地区地梢瓜，符合我省有关长白山地区药用动植物资源开发利用的政策.本文首次针对地梢瓜中总黄酮和总三萜的提取、纯化工艺及镇痛、抗炎作用进行了系统研究：确定了地梢瓜总三萜及总黄酮的提取方法，优化了其提取工艺，并通过动物试验确定了地梢瓜中两种有效部位的抗炎、镇痛作用及其可能的作用机制.地梢瓜的营养价值和药用价值均较高，且对环境的适应性强，十分容易存活，可以大量的人工培植.因此，本研究为药食两用植物地梢瓜在食品、医药领域的进一步开发利用提供科学依据.