环状RNA-ITGA1促进三阴性乳腺癌进展和转移

王泽坤，李亚明，杨靖雯，杨其峰,

乳腺癌是一种严重危害女性生命健康的恶性肿瘤，在全球范围内其发病率不断升高，约占全球女性恶性肿瘤发病率的24%[1]。目前，国际通用的乳腺癌分类标准可将乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性型、三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）及其他特殊类型乳腺癌[2-3]。TNBC大约占全部乳腺癌的15%，该类型的乳腺癌以雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）及HER2表达均阴性为特点。TNBC好发于年轻女性，其相对于其他类型的乳腺癌具有生长速率快、侵袭性强、容易出现复发及内脏转移的生物学特征，同时其缺乏内分泌及抗HER2治疗的靶点，目前尚无针对性的标准治疗方案，患者的5年生存率不足30%[4]。因此，急需寻找TNBC的新型诊断标记物及分子治疗靶点。

非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）是一类缺乏开放阅读框（open reading frame，ORF）、无法被翻译成为蛋白质的RNA，其已被证明可以在肿瘤的发生、发展及恶性生物学行为过程中起到至关重要的作用[5]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是非编码RNA家族中的一种，不具有编码蛋白的能力但可参与调控细胞生物学过程，与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，其由前体mRNA经由反向剪接反应形成，因此具有特殊的剪接位点及序列；circRNA在发现之初被认为是mRNA错误剪接的产物[6-7]。同时circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解，并具有高度稳定性和组织特异性[8]。

近年来，各种研究表明circRNA在肿瘤细胞内的异常表达参与了肺癌、肝癌和膀胱癌等多种肿瘤的发生和发展过程[9-11]。CircRNA在TNBC中的调控功能也有过相关报道，如circAGFG1可通过调控miR-195-5p/CCNE1信号轴促进TNBC的进展[12]，circRNA_069718可以通过激活Wnt/beta-catenin通路促进TNBC的增殖及侵袭能力[13]，circIFI30可以促进TNBC的进展并与TNBC患者的预后密切相关[14]。综上所述，circRNAs可以在TNBC的进展转移过程中起到重要的作用，但有关circRNA在TNBC中的具体功能及分子机制仍不明确，亟待进一步的研究。

本研究中首先利用高通测序技术检测发现，circRNA hsa-circ-0004840 [circ-整合素α1（integrin alpha 1，ITGA1）]在高转移能TNBC细胞中呈现显著高表达状态。随后发现，干扰circ-ITGA1表达可以显著抑制TNBC细胞的增殖、迁移及侵袭能力，过表达circ-ITGA1则可以促进TNBC细胞的上述恶性生物学行为，并且circ-ITGA1可能是通过影响miR-624-5p/LMBRL1信号轴发挥相应的功能。本研究证明了circ-ITGA1在TNBC的进展转移过程中发挥了重要的作用，为进一步理解TNBC进展转移的分子机制提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器

人正常乳腺上皮MCF-10A细胞以及乳腺癌MCF-10AT、MCF-10CA1A、MCF-10CA1H、HS578T、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞购自美国菌种保藏中心。DMEM培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国HyClone公司，胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自中国碧云天生物技术公司。LipofectAMINETM 2000购自美国Invitrogen公司。RNA抽提试剂盒购自南京诺唯赞医疗科技有限公司，反转录试剂盒购自长沙艾科瑞生物工程有限公司、PCR扩增试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司、EdU试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司、MTT购自北京索莱宝科技有限公司、Transwell小室购自美国Corning公司，结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术公司。特异性针对circ-ITGA1的siRNA（sicirc-ITGA1-1和sicirc-ITGA1-2）及阴性对照（negativecontrol，NC）（siNC）购自上海铂尚生物技术有限公司。siNC的正义链序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’反义链序列为5’-AAACGTGACACGTTCGGAGAA-3’；sicirc-ITGA1-1的正义链序列为5’-AACAGACA CAGGGTGCTTATT-3’，反义链 序列为5’-AATAAGCACCCTGTGTCTGTT-3’；sicirc-ITGA1-2的正义序列为5’-TAAACAGACACAGG GTGCTTA-3’，反义链序列为5’-TAAGCACCC TGTGTCTGTTTA-3’。携带有特异性针对circ-ITGA1的重组过表达（overxexpression，OE）载体（PLCDH-circ-ITGA1-OE）及空载质粒PLCDH（对照）购自广州吉赛生物科技股份有限公司。

实时荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad公司产品，光学显微镜为美国Thermo Fisher Scientific公司产品，全自动酶标仪为美国Bio-Tek公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RNA测序

建立TNBC细胞系MDA-MB-231的高转移能细胞MDA-MB-231-M，提取细胞总RNA；用RNase R将RNA消化为线性RNA，行琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。将RNA送联川生物技术股份有限公司进行高通量测序，并利用生物信息学分析方法分析测序结果，筛选出亲本MDA-MB-231细胞和高转移能MDA-MB-231-M细胞中差异表达的circRNAs。

1.2.2 细胞培养与转染

将乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞用含青链霉素双抗及10% FBS的DMEM培养液（完全培养液），置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中进行培养，每隔24～48 h更换培养液。待细胞在融合度为90%～100%时，更换为无血清培养液饥饿细胞；使用LipofectAMINETM 2000分别将siRNA（sicirc-ITGA1-1、sicirc-ITGA1-2及siNC）或重组过表达载体（PLCDHcirc-ITGA1-OE及空载体PLCDH）转入MDAMB-231和MDA-MB-468细胞中，8～10 h后更换为含血清的完全培养液，24 h后再更换为有血清的培养液。circ-ITGA1过表达组中还需在24～36 h后加入终浓度为2.5 μmol/mL的嘌呤（puro）进行筛选，最终筛选出稳定过表达circ-ITGA1的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测

转染24～36 h后，采用RNAeasy法提取MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的总RNA，用DEPC处理后的去离子水溶解RNA。用Nanodrop 2000分光光度计检测提取RNA浓度与纯度。将提取获得的总RNA按照10 μL体系反转录为cDNA，反应条件为37 ℃ 20 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保存。以cDNA为模板，进一步采用实时荧光定量PCR法检测circ-ITGA1的表达水平（以β-actin为内参照）；反应体系为Syber green、引物（内参或目的基因）和cDNA（共计10 μL）；反应条件为94 ℃预变性3 min，98 ℃变性5 s，55～68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个样品设置3个复孔，应用2-△△Ct法计算circ-ITGA1在样品中的相对表达量。

所用引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。circ-ITGA divergent上游引物序列为5’-TG CTGGATGGTTCCAACAGT-3’，下游引物序列 为5’-CACCTCTCCCAACTGGACAC-3’；circ-ITGA convergent上游引物序列为5’-TGC TTATTGGTTCTCCG-3’，下游引物序列为5’-TTGAAATGTGGGGCTGA-3’；ITGA1基因上游引物序列为5’-CCGAAGAGGTACTTG TTGCAGC-3’,下游引物序列为5’-GGCTTCC GTGAATGCCTCCTTT-3’；β-actin基因（内参照）上游引物序列为5’-CACCATTGGCAATGA GCGGTTC-3’,下游引物序列为5’-AGGTCT TTGCGGATGTCCACGT-3’。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞中分别干扰及过表达circ-ITGA1。将各对照组和实验组细胞用胰蛋白酶消化后，用培养液重悬细胞制成细胞悬液并计数。以1 500个细胞/孔的密度接种于96孔板中（共设置6块板），每孔中用含有10% FBS的DMEM培养液将体积补齐至100 μL。从细胞接种24 h起，每24 h同一时间在其中一块板中加MTT染料，4～6 h后在免疫酶标仪波长490 nm处检测各孔的D值。连续检测6 d，并根据D值绘制成细胞的生长曲线。

1.2.5 EdU实验检测细胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞系中分别干扰及过表达circ-ITGA1后，将细胞培养至对数生长期阶段，即大约占培养皿面积的60%～70%，然后将细胞种到96孔板中，每孔约1×104个细胞。过夜（培养至正常生长阶段），每孔加入100 μL含Edu的培养液（EdU溶液与细胞完全培养液的体积稀释比例为1∶1 000），孵育2 h，弃培养液，每孔加入在4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.5%在TritonX-100溶液通透10 min后，随后根据体外试剂盒说明书对细胞核进行染色，在荧光显微镜下随机挑选3个视野进行取像和计数。

1.2.6 克隆形成实验检测细胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞中分别干扰及过表达circ-ITGA1后，将细胞培养至对数生长期阶段，将各对照组、实验组细胞用胰蛋白酶消化后，加入完全培养液重悬细胞，制成细胞悬液并计数。将细胞接种至6孔板中，每种细胞设置3个复孔，每孔约800个细胞，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，每隔3 d换液并观察细胞形态，3～6周后吸弃培养液，用PBS洗涤1遍，用100%甲醇溶液固定细胞15～20 min，除去甲醇溶液，加入结晶紫染色15～20 min，用三蒸后的去离子水清洗细胞，晾干后拍照保留结果。

1.2.7 划痕实验检测细胞的横向迁移能力

在MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞系中分别干扰及过表达circ-ITGA1后，将细胞各组细胞接种于24孔板中（2×105个细胞/孔）；24 h后用PBS清洗细胞3遍，最后1遍清洗时不吸走PBS，使用10 μL枪头在24孔板内进行划痕，置于倒置光学显微镜下拍摄0 h划痕距离，更换无血清培养液，随后将24孔板放置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h，再置于倒置光学显微镜下拍摄24 h时的划痕距离，然后计算出愈合率，与0 h进行比较，即可得出细胞的相对迁移能力。

1.2.8 Transwell小室实验检测细胞的纵向迁移能力和侵袭能力

将700 μL含有20% FBS的DMEM培养液加入24孔板中作为下室，将Transwell小室放入其中，作为上室。将MDA-MB-231细胞（6×104个/孔）和MDA-MB-468细胞（8×104个/孔）制成200 μL无血清的细胞悬液，接种于上室中，将设有小室的24孔板缓慢水平放置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h（MDAMB-468细胞需培养48 h）。用PBS轻轻洗涤1～2遍，用甲醇溶液固定细胞15 min，吸弃甲醇溶液，用结晶紫染料染色15 min后用三蒸去离子水轻柔洗净，用棉球轻轻擦去上室中未穿过小室膜的细胞，干燥后在光学显微镜下随机取3个视野拍照并计数。

细胞侵袭实验中首先在小室膜上铺设基质胶，其余步骤同细胞迁移实验。

1.2.9 统计学方法

利用Graph Pad Prism 9.0统计学软件对实验数据进行统计学处理，所有实验均独立重复3次，计量资料以表示。对于2组数据，选择t检验的方法进行分析，而对于多组间数据首先选择单因素方差分析，再行组内两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Circ-ITGA1在TNBC高转移能细胞中高表达

为了筛选与TNBC进展转移相关的circRNAs，本研究前期即建立了MDA-MB-231细胞的高转移能细胞MDA-MB-231-M。利用高通量测序的方法检测了2组细胞间差异表达的circRNAs。结果显示（图1A），共有6 283个circRNAs在高转移能MDA-MB-231-M细胞中高表达，4 667个circRNAs在MDA-MB-231-M细胞中表达降低。利用该高通量测序结果检出的circRNAs的长度分布及分类如图所示（图1B和图1C），选择表达变化最为显著的5个上调的circRNAs及5个下调的circRNAs（图1D）。

采用实时荧光定量PCR法检测乳腺癌细胞系中的各circRNAs表达量，结果发现circ-ITGA1在TNBC细胞系中显著上调且与乳腺癌细胞的恶性程度呈正相关（图1E），同时通过检索Mioncocirc数据库[15]发现circ-ITGA1在人体各种类型肿瘤中广泛表达（图1F）。最后，在MDA-MB-231及高转移能细胞系MDA-MB-231-M中检测了该circRNA的表达水平，发现circ-ITGA1在高转移能细胞系中同样显著调（P＜0.01）（图1G）。上述结果提示，circ-ITGA1表达水平与乳腺癌细胞的恶性程度呈正相关，其可能在TNBC细胞的进展转移中发挥重要的生物学功能。

Fig.1 Circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) was up-regulated in metastatic TNBC cells.A:Heatmap of the significantly differentially expressed circRNAs between MDA-MB-231 and its highmetastatic MDA-MB-231-M cells.B:The length of identified circRNAs was presented.C:The types of identified circRNAs were presented.D:Five most significantly up-regulated and down-regulated circRNAs based on RNA-seq were presented.E:The expression level of circ-ITGA1 in breast cancer cells (MCF-10AT,MCF-10CA1A,MCF-10CA1H,HS578T,MCF-7,SK-BR-3,MDA-MB-453,MDA-MB-231 and MDAMB-468),and the human normal breast epithelial cells MCF-10A as the control.F:The expression level of circ-ITGA1 in different tissues based on Mioncocirc database.G:The expression level of circ-ITGA1 was detected in MDA-MB-231 and its high-metastatic MDA-MB-231-M cells with different high-metastatic abilities detected by real-time fluorescent quantitative-PCR.**P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).ACC:Adenoid cystic carcinoma;BLCA:Bladder urothelial carcinoma;BRCA:Breast invasive carcinoma;CHOL:Cholangiocarcinoma;COLO:Colorectal cancer;ESCA:Esophageal carcinoma;GBM:Glioblastoma multiforme;HCC:Liver hepatocellular carcinoma;HNSC:Head and neck squamous cell carcinoma;KDNY:Kidney cancer;LUNG:Lung cancer；OV:Ovarian serous cystadenocarcinoma;PAAD:Pancreatic adenocarcinoma;PRAD:Prostate adenocarcinoma;SARC:Sarcoma;SECR:Secretory cancer;SKCM:Skin cutaneous melanoma.图1 circ-ITGA1在高转移TNBC细胞系中表达上调

2.2 验证Circ-ITGA1在TNBC细胞中为circRNA

通过检索UCSC Genome Browser数据库[16]发现，circ-ITGA1由ITGA1基因的3～6号外显子反向剪接形成，其成熟体circRNA的长度为442 nt。因此，本研究中首先设计了特异性针对circ-ITGA1反向引物（divergent primer）及正向引物（convergent primer），并利用反向引物扩增circ-ITGA1的反向剪接位点，并通过Sanger测序技术成功的检测到了circ-ITGA1的剪接点特异性序列，该序列与circBase数据库[17]展示的序列一致。证明了TNBC细胞内存在circ-ITGA1（图2A）。

由于circRNA具有抵抗核糖核酸酶R（RNAse R）消化的特性，本研究中利用RNAse R对MDA-MB-231细胞总RNA进行处理，并采用PCR法检测circ-ITGA1对RNAse R的抵抗能力。结果显示（图2B），利用divergent引物特异性扩增circ-ITGA1，在有无RNase R处理的情况下均可扩增出产物；利用convergent引物扩增线性RNA，在无RNase R处理时可以有效扩增出PCR产物，而在RNase R处理的情况下，PCR产物显著降低（MDA-MB-231细胞）甚至无法有效扩增（MDA-MB-468细胞）（P＜0.01）。这一结果表明，circ-ITGA1为circRNA，并且耐受RNase R消化。同时，以细胞基因组DNA（genomic DNA，gDNA）或cDNA为模板，分别用divergent primer和convergent primer对circ-ITGA1及β-actin（内参照）的进行扩增，发现circ-ITGA1仅在cDNA中可被检测出来，未在gDNA中发现，符合circRNA的特性（图2C）。

随后，用放线菌素D处理MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞（0、4、8、12和24 h），并采用实时荧光定量PCR法检测circ-ITGA1及本底基因ITGA1表达水平的变化。结果（图2D）表明，相较于线性ITGA1基因的mRNA，circ-ITGA1具有更高的稳定性及更长的半衰期（P＜0.05）。

Fig.2 Characterization of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) as a circular RNA in triplenegative breast cancer (TNBC) cells.A:The schematic diagram indicates the genomic loci of circ-ITGA1 and the designation of divergent and convergent primers.Sanger sequencing conducted following PCR using the indicated divergent flanking primers confirmed the “head-to-tail” splicing of circ-ITGA1.B:RNase R treatment was subjected to PCR with divergent or convergent primers.The relative expression level was detected by realtime fluorescent quantitative PCR.C:RT-PCR with divergent or convergent primers indicated the existence of circ-ITGA1 in cDNA,but not in gDNA (β-Actin was used as a negative control).D:Quantitative real-time fluorescent quantitative indicated the abundance of circ-ITGA1 and the ITGA1 mRNA in TNBC cells after treatment with actinomycin D at the indicated time points.E:The relative expression levels of circ-ITGA1 and ITGA1 in TNBC cells were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR after normalization to random primers and oligo (dT) primers.*P＜0.05,**P＜0.001,vs ITGA1 group (n=3)图2 TNBC细胞系中circ-ITGA1环状特性的验证

由 于mRNA具 有poly（A）尾 部，而circRNA因其特殊环状结构不具备poly（A）尾部，因此最后分别利用反转录试剂盒中的OligodT引物及Random引物对细胞总RNA进行反转录，随后行实时荧光定量PCR法检测。结果（图2E）显示，circ-ITGA1在Oligo-dT组中表达水平显著降低，而ITGA1 mRNA的表达水平则无明显变化（P均＜0.01），表明circ-ITGA1不具备poly（A）尾部结构。

2.3 干扰circ-ITGA1的表达水平可以抑制TNBC细胞的增殖能力

为了检测circ-ITGA1对TNBC细胞生物学功能的影响，本研究中在TNBC细胞中转入针对circ-ITGA1特异性的siRNA。实时荧光定量PCR结果（图3A）显示，相较于转入siNC的对照组细胞，sicirc-ITGA1-1和sicirc-ITGA1-2组MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中circ-ITGA1的表达水平均明显降低（P均＜0.01），验证了siRNA的干扰效率。

Fig.3 Knockdown of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) inhibited proliferation of TNBC cells.A:The knockdown efficiency of circ-ITGA1 siRNAs.B:The proliferation rates of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells were examined by MTT assay.C:The proliferations of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells were examined by colony formation assay.D:The proliferation activities of MDA-MB-231 and MDAMB-468 cells were determined by EdU assay (×200).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs SiNC group (n=3).图3 下调circ-ITGA1表达抑制TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的增殖能力

随后，采用MTT法及克隆形成实验检测下调circ-ITGA1表达对MDA-MB-231和MDAMB-468细胞增殖能力的影响。结果（图3B和图3C）显示，干扰circ-ITGA1表达后，MDAMB-231和MDA-MB-468细胞的增殖能力均明显降低（P均＜0.01）。进一步利用EDU实验检测对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞增殖活性的影响，结果（图3D）显示干扰circ-ITGA1表达后，细胞的增殖活性均被明显抑制（P均＜0.05）。

2.4 下调circ-ITGA1表达可以抑制TNBC细胞的侵袭及迁移能力

为了进一步验证circ-ITGA1的生物学功能，干扰circ-ITGA1表达后采用Transwell小室实验检测对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞纵向迁移和侵袭能力的影响。结果显示，干扰circ-ITGA1表达后，MDA-MB-231和MDAMB-468细胞的纵向迁移能力均被明显下调（P均＜0.01）（图4A）。同样，细胞的侵袭能力也受到的抑制（P均＜0.01）（图4B）。同时本研究中采用划痕实验检测了对MDA-MB-231和MDAMB-468细胞横向迁移能力的影响，结果（图4C）显示干扰circ-ITGA1表达后，MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的迁移距离均被明显降低（P均＜0.01）。结果表明，干扰circ-ITGA1的表达水平可以抑制TNBC细胞的侵袭及迁移能力。

Fig.4 Knockdown of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) suppressed migration and invasion of triple-negative breast cancer cells.A:Transwell assay showed the migration abilities of TNBC cells were inhibited (×100).B:The invasion abilities of TNBC cells were suppressed after circ-ITGA1 knockdown (×100).C:Wound healing assay confirmed the migration abilities of TNBC cells were inhibited(×100).**P＜0.01,***P＜0.001 vs siNC group (n=3).图4 下调circ-ITGA1表达抑制TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的侵袭及迁移能力

Fig.5 Overexpression of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) promoted the proliferation,migration and invasion of triple-ngative brease cancer TNBC cells.A:The efficiency of circ-ITGA1 overexpression in TNBC cells.MTT (B) and colony formation (C) assay showed the proliferation rates of TNBC cells were increased by circ-ITGA1.D:The proliferative activities of TNBC cells were enhanced with circ-ITGA1 overexpression (×200).The migration (E) and invasion (F) abilities of TNBC cells were promoted after circ-ITGA1 overexpression (×100).G:Wound healing assays confirmed the migration abilities of TNBC cells were increased by circ-ITGA1 (×100).**P＜0.01,***P＜0.001 pbCON group (n=3).图5 过表达circ-ITGA1促进TNBC细胞增殖、侵袭和迁移

2.5 过表达circ-ITGA1表达水平可以促进TNBC细胞的增殖、侵袭及迁移能力

为了进一步验证circ-ITGA1对TNBC细胞生物学功能的影响，本研究再在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中使circ-ITGA1过表达。（P均＜0.01）（图5A）。随后，采用MTT法及克隆形成实验检测了细胞的增殖能力。结果发现，过表达circ-ITGA1后，TNBC的细胞增殖速率显著升高（P均＜0.01）（图5B、C）。同时，EDU实验显示过表达circ-ITGA1后细胞的增殖活性显著升高，与之前所述结果相吻合（P均＜0.01）（图5D）。进一步利用Transwell实验证明了过表达circ-ITGA1后细胞的侵袭及迁移能力均有显著的升高（P均＜0.01）（图5E，F）。同时划痕实验也证明了circ-ITGA1对细胞迁移能力的促进作用（P均＜0.01）（图5G）。综上所述，我们的结果表明，过表达circ-ITGA1的表达水平可以促进TNBC细胞的增殖、侵袭及迁移能力。

2.6 circITGA1影响TNBC细胞增殖、侵袭和转移可能的作用机制

研究表明，circRNA可以吸附微RNA（microRNA，miRNA），而miRNA又能与mRNA结合从而诱导基因沉默，故circRNA被当作一种内源竞争性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），与miRNA竞争性的结合，从而降低miRNA对于靶mRNA转录的抑制作用，促进靶mRNA的表达，形成circRNA-miRNA-mRNA的调控体系，在恶性肿瘤的发生和发展中起着重要作用[18]。通过Circbank[19]和Circinteractome[20]2个网站来预测可能与circITGA1结合的miRNAs，二者取交集，共得到5个可能的靶miRNAs，分别 为has-miR-136-5p、has-miR-338-3p、hasmiR-582-3p、has-miR-589-3p和has-miR-624-5p（图6A）。接着用Metabric[21]和TCGA[22]数据库分析这5个靶miRNAs对于TNBC患者预后的影响，发现仅有高表达has-miR-624-5p组的预后明显优于低表达组，与circ-ITGA1的功能相一致（图6B）。图6C则展示了circITGA1与hasmiR-624-5p的结合位点。接着通过miRNet[23]网站预测到了127个可能与miR-624-5p结合的靶基因。进一步利用Mioncocirc数据库预测在乳腺癌患者中与circ-ITGA1表达呈正相关的基因共3 861个，对2组结果取交集，共得到3个感兴趣的基因，分别为LMBR1L、MAP3K1和LONRF2（图6D）。图6E则展示了这3个基因与circ-ITGA1表达的相关性。为了进一步筛选可能的靶基因，本研究中再利用TCGA数据库探究了TNBC患者中miR-624-5p与基因表达的相关性。结果表明，仅有LMBR1L的表达与miR-624-5p呈负相关，符合ceRNA的表达趋势（图6F）。同时，利用Metabric和TCGA分析LMRB1L的表达对于TNBC患者预后的影响，发现LMBR1L与患者的预后呈负相关（图6G）。由此推测，circ-ITGA1可能是通过竞争性地结合has-miR-624-5p从而降低has-miR-624-5p对LMBR1L的，进而发挥促进肿瘤进展转移的功能（图6H）。

3 讨 论

作为世界3大癌症之一，乳腺癌深深威胁着女性身体健康[24]。近年来，随着医学不断进展，对乳腺癌的研究有了突破性的进展，应对各类乳腺疾病的能力不断提高，乳腺癌的临床诊治能力不断提高，人们对乳腺健康的关注度不断提高，但乳腺癌发病率仍增长迅速，甚至成为发病率第一的癌症类型[25]

专家学者尝试从各种途径来探讨乳腺癌的发生发展机制，近年来，随着生物信息学以及RNA-seq的飞速发展，使得用高通量测序技术进行测序分析成为可能，能直观反映出circRNA和长链非编码RNA等的表达水平，这也推进了非编码RNA的研究，使其逐渐成为当下研究领域热门话题。非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA，包括circRNA、长链非编码RNA、miRNA、rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。这些RNA均由基因组转录得到，大多不翻译为蛋白质，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能，参与调节多种细胞生物学过程。

Fig.6 MicroRNA (miR)-624/LMBR1L could be the potential target of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1).A:The target miRNAs of circ-ITGA1 were predicted by circBank and Circinteractome database,and 5 miRNAs were filtered out.B:The prognosis of TNBC patients with different miR-624 expression in Metabric and TCGA databases.C:The predicted binding sites of circ-ITGA1 and miR-624.D:The potential target genes of miR-624 were predicted by using miRNet and Mioncocirc databases,and 3 genes were selected.E:The correlation between circ-ITGA1 and LMBR1L,MAP3K1 and LONRF2 expression.F:The correlation between miR-624 and LMBR1L,MAP3K1 and LONRF2 expression.G:The prognosis of TNBC patients with different LMBR1L expression in Metabric and TCGA databases.H:The potential molecular mechanisms of circ-ITGA1/ miR-624/LMBR1L axis.图6 miR-624/LMBR1L信号轴可作为circ-ITGA1的潜在分子靶点。

circRNA是当下热点的研究方向，其是一种特殊的非编码RNA，它没有5’帽子结构和3’ poly（A）尾，为共价闭合、单链环状结构，对核酸外切酶不敏感，因此比普通的线性RNA（linear RNA）更稳定。研究还发现，circRNA具有细胞和组织特异性，广泛存在于真核生物转录组中，主要位于细胞质中，也有部分位于细胞核中[26]。研究表明，circRNA可以参与多种肿瘤的发生和发展过程[27]。在乳腺癌中，已有报道如circRNA_0025202可以调控乳腺癌细胞对它莫西芬的耐药性[28]；Hsa_circ_001783可以通过吸附miR-200c-3p影响乳腺癌的进展和转移[29]等。然而有关circRNA影响TNBC的具体功能及机制仍不甚明确，因此本研究中首先采用RNA高通量测序技术，对乳腺癌细胞系进行了测序分析，通过差异表达谱以及实时荧光定量PCR技术证实circ-ITGA1在高转移能细胞系中显著高表达，因此提示circ-ITGA1可能能够影响TNBC的进展和转移能力。为了进一步研究circ-ITGA1的相关功能，构建了针对circ-ITGA1的siRNA，经一系列体外实验发现下调circ-ITGA1之后，细胞的增殖、转移、侵袭等生物学行为受到抑制；随后构建了针对circ-ITGA1的重组过表达质粒，通过脂质体转染法转染进TNBC细胞，进行体外功能实验验证，发现过表达circ-ITGA1促进了TNBC细胞的增殖、转移、侵袭等生物学行为，进一步验证了circ-ITGA1的异常表达对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。这些结果表明，circ-ITGA1在乳腺癌的发生和发展中可能发挥重要的作用。

基于文献报道，circRNA行使其相关功能的机制主要是：（1）作为海绵吸附microRNA，抑制miRNA对mRNA的降解或阻碍其翻译；（2）诱导血管生成；（3）与RNA结合蛋白相互作用；（4）促进肿瘤免疫逃逸；（5）促进肿瘤微环境形成等多种方式参与乳腺癌的增殖、侵袭和转移等[30]。为了进一步研究circ-ITGA1发挥功能的相关的分子作用机制，本研究中首先分析了可能与circ-ITGA1结合的miRNAs，其中miR-624-5p在数据库中表现为抑癌基因表型，高表达miR-624-5p的TNBC患者呈现较好的预后。同时基于文献报道，miR-624-5p在肿瘤中参与了多种促癌相关非编码RNAs的分子机制，如hsa_circ_0091579可以通过调控miR-624/H3F3B信号轴从而促进“Warburg效应”并促进肝细胞癌的恶性生物学行为[31]；长链非编码RNA LncRNAZFAS1可以通过调控miRNA-624/MDK/ERK/JNK/P38信号轴从而促进肝细胞癌的进展和转移过程等[32]。因此，miR-624可作为circ-ITGA1潜在的靶miRNA。同时，为了进一步分析circ-ITGA1/miR-624的分子机制，我们利用数据库分别筛选与circ-ITGA1呈表达正相关及与miR-624表达呈负相关的基因，筛选出LMBR1L可能作为下游靶基因。

综上所述，circRNA circ-ITGA1可以通过调控miR-624/LMBR1L信号轴进而调控TNBC的进展和转移进程，有望成为TNBC治疗的新靶点。