LC-MS/MS 法测定盐酸莫西沙星中酰氯类遗传毒性杂质

曹 颖，朱 飞，霍立茹，*

1 徐州医科大学，徐州 221000；2 南京济群医药科技股份有限公司，南京 211100

莫西沙星作为第四代喹诺酮类抗菌药，临床应用为盐酸盐的形式。其在前三代药物的基础上进行了结构修饰，具有抗菌谱广、抗菌能力强、疗效好、不良反应少等优点，因此在临床得到广泛的应用[1]。在盐酸莫西沙星合成工艺中用到了2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯，此为潜在遗传毒性杂质[2]。该类杂质在极微量的水平就能诱导DNA 发生突变，严重威胁人类的健康，因此有必要建立盐酸莫西沙星中2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的检测方法。

酰氯类化合物的性质非常活泼，原型结构不易直接检测[3]，目前文献报道中多采用衍生化法对酰氯进行测定[4-9]。主要有水解法和醇解法，使酰氯结构转化为相应的羧酸和酯进行检测；但是醇解法对反应体系中的含水量要求较高，必须严格控制操作环境以及样品中的水分，检测比较复杂。此外，根据EMA、美国FDA 以及ICH M7[10-12]中相关指导原则要求，遗传毒性杂质的毒理学关注阈值（TTC）为1.5 μg/天。莫西沙星制剂一般日最大使用剂量为400 mg，所以盐酸莫西沙星中2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的限度为3.75 ppm，限度很低，普通的液相色谱方法达不到灵敏度要求，目前尚未见到盐酸莫西沙星中酰氯类遗传毒性杂质研究的相关报道。

本文采用LC-MS/MS 法，以水解法对2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯进行衍生化后测定，操作简单，不仅满足了遗传毒性杂质痕量研究中的高灵敏度要求，也解决了酰氯结构的不稳定性对测定带来的影响，同时也为其他酰氯类物质的检测提供参考。

1 材 料

1.1 仪器

U3000 高效液相色谱仪（Thermo-Fisher)；API 4000 三重四级杆质谱仪（AB Sciex）；CPA225D 电子分析天平（精度：0.01 mg），赛多利斯；MSA6.6S 电子分析天平（精度：0.001 mg），赛多利斯。

1.2 药品与试剂

2，4，5-三 氟-3-甲氧基苯甲酰氯（批号：1772231M-SY-01，纯度：97.9%）（深圳市斯坦德华工科技有限公司）；盐酸莫西沙星原料药（批号：MX1712001、MX1712002、MX1712003）（南京济群医药科技股份有限公司）。

甲酸（批号：6F2941）（ROE）；甲醇（批号：I0887507717，Merck）为色谱级；乙腈（批号：1823829614，Merck）为质谱级。试验水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 液相色谱-质谱条件

2.1.1 液相色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.1%甲酸（75∶25）；柱温：40 ℃；流速：0.2 mL·min-1；进样量：5 μL；分析时间：5 min。

2.1.2 质谱条件 选用电喷雾离子源（ESI），设定源参数分别为：喷雾电压-4200 V，辅助气150 Pa，辅助气250 Pa，辅助气加热温度450 ℃，气帘气20 Pa，碰撞气1 Pa。

设定Q0 入口电压为-10V，Q2 出口电压为-15V。负离子检测模式，MRM：205.0/160.8，去簇电压为-30 V，碰撞电压为-14 eV。

2.2 衍生化条件

将水作为衍生化试剂，取盐酸莫西沙星约20mg，置10 mL 量瓶中，加1 mL 水使溶解，室温条件下超声5 min，将盐酸莫西沙星中可能存在的2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯转化为性质更稳定的2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸来进行测定。

2.3 溶液配制及检测

取2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯约1 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，加水溶解超声振荡5 min并稀释至刻度，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液适量，加甲醇逐级稀释成2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的浓度约为0.5、1、2、5、10、20 ng·mL-1的系列溶液，作为标准溶液。

取盐酸莫西沙星原料药约20 mg，置10 mL 量瓶，加1 mL 水，室温条件下超声振荡5 min，再用甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。

精密量取标准溶液与供试品溶液各5 μL，分别进样测定，按标准曲线法计算含量。

2.4 分析方法验证

2.4.1 质谱分析 负离子模式下在2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯水解衍生物（2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸）准分子离子峰（M-H-）为m/z=205.0，在其二级裂解质谱图中，丰度最强的子离子峰为m/z=160.8，为2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸脱去羧基（-COOH）所形成的，裂解质谱图见图1。

图1 2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸m/z=160.8 的二级裂解质谱图

2.4.2 专属性试验 在所建立的色谱和质谱条件下，2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的水解衍生物2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸的保留时间为0.99min，空白溶剂在此处无峰检出，对2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的测定无干扰，表明方法专属性良好。见图2。

图2 专属性试验图谱

2.4.3 定量限与检测限设立 取上述“2.3”项下对照品贮备液适量，加甲醇逐级稀释成一定浓度的溶液，分别以信噪比S∶N=10∶1 及3∶1 时的浓度作为定量限及检测限，结果该方法下2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的定量限浓度为0.40 ng·mL-1（相当于供试品浓度的百分比为0.20 ppm）；检测限浓度为0.080 ng·mL-1（相当于供试品浓度的百分比为0.04 ppm），这表明2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的定量限浓度明显低于限度浓度（3.75 ppm），方法灵敏度符合要求。

2.4.4 线性与范围 精密量取“2.3”项下对照品贮备液适量，加甲醇稀释成浓度分别为0.485、3.856、4.627、7.712、11.569、15.425 ng·mL-1的系列溶液，取各溶液5 μL，按“2.1”项下液质条件进样，以2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的浓度C（ng·mL-1）为横坐标（X），2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸的峰面积A为纵坐标（Y），进行线性回归。回归方程为：Y=3.82×104X-1.439×103，r=0.999 9，这表明2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯在0.485～15.425 ng·mL-1浓度范围内，线性关系良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密量取“2.3”项下对照品贮备液适量，加甲醇逐级稀释成浓度约为75 ng·mL-1的溶液，作为回收率外加对照品贮备液。另取盐酸莫西沙星原料约20 mg，置10 mL 量瓶中，平行配制3 份，分别加1 mL 水超声使溶解，再分别精密量取对照品贮备液0.5、1.0、1.5 mL，置上述10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，平行配制3 份。分别精密量取各溶液5 μL 进样，按“2.1”项下液质条件检测。结果表明，2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯回收率在101.6%～111.2%，RSD 为3.7%，符合要求。见表1。

表1 回收率试验结果

2.4.6 进样精密度试验 精密量取浓度约为75 ng·mL-1的回收率外加对照品贮备液5 μL，按“2.1”项下液质条件检测，连续进样6 次，记录峰面积，结果2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯水解物峰面积的RSD 为2.1%（n=6），表明仪器进样精密度良好。

2.4.7 重复性试验 按“2.3”项下方法，平行配制6份供试品溶液。按“2.1”项下液质条件检测，结果6份样品均未检出杂质。

另配制含2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯约7.5 ng·mL-1的供试品溶液6 份，按“2.1”项下液质检测，以含量结果的RSD 作为评价指标。6 份样品的含量均为0.0004%，RSD 为3.0%，表明方法重复性符合要求。

2.5 样品杂质检测

取盐酸莫西沙星原料药3 批，按照“2.3”项下方法配制供试品溶液，按“2.1”项下液质条件分别进样测定，记录峰面积，按标准曲线法计算酰氯残留量。结果3 批原料药中均未检出2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯。

3 讨论

3.1 衍生化时间和温度的考察

采用水解法对酰氯进行衍生化，以水超声溶解样品的方式使酰氯结构水解成羧酸进行检测。考察了不同温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）对衍生化反应的影响，以回收率为指标来考察酰氯是否完全转化为相应的羧酸，结果表明，温度对衍生化反应几乎没有影响，故选择在室温条件下进行衍生化反应。

在室温条件下，考察了反应时间（3、5、7、10、15 min），同样以回收率作为考察指标。结果表明一般室温条件下超声3～15 min 该酰氯杂质均能水解完全。为了实验操作的方便性，选择室温条件下超声5 min 作为衍生化的条件

3.2 液相色谱条件的确定

考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液等不同的流动相组成，以及有机相比例（50%、60%、75%），结果发现，75%乙腈时的杂质响应和峰形较好，流动相中加入甲酸对峰形有改善作用且未对离子化效率产生不利影响，有机相的比例提高也有利于离子化效率的提高，从而得到更高的灵敏度。故选择乙腈-0.1%甲酸水溶液（75∶25）作为流动相。

在进行回收率试验时，供试品溶液直接全部以水做溶剂时，因离子化效率低导致回收率偏低，采用先加适量水超声溶解后，再以甲醇稀释至所需浓度的方式，离子化效率明显提高。

综上，本方法能够对盐酸莫西沙星中的酰氯类遗传毒性杂质进行准确测定，方法专属性强，灵敏度高，能满足遗传毒性杂质痕量研究的要求，可作为盐酸莫西沙星中的酰氯类杂质的质量控制方法。