聚乙二醇修饰的槲皮素磁性分子印迹聚合物合成及其应用

曹玉天， 盛万里， 齐小花， 张 伟， 谢子奇，罗云敬*， 邹明强

(1.北京工业大学环境与生命学部，环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室，北京 100124；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；3.呼和浩特海关技术中心，内蒙古呼和浩特 010020)

槲皮素(Quercetin，Que)是一种广泛存在于植物果实、茶叶、红酒等物质中的天然多羟基黄酮类化合物[1]，具有抗氧化[2]、抗衰老[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5,6]等药用价值。然而，在天然产物中Que的含量却很低，且结构与其他黄酮类化合物相似，基质复杂难于分离，因此，探究复杂基质中Que的分离与含量测定极为重要。目前，Que常用分离方法包括溶剂萃取法、超临界萃取法和大孔树脂吸附法等[7]。但溶剂萃取法只适用于粗提取；超临界萃取法成本过高；树脂吸附法分离效果低，特异性差。近年来发展起来的分子印迹技术能够制备出能特异识别目标分子的分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)，有望实现复杂基质中微量组分的分离。廖辉等[8]采用分子印迹技术制备Que-MIPs，该Que-MIPs对Que及结构类似物芦丁(Rutin,Rut)的分离因子α为1，表明MIPs对Que具有良好的特异性吸附。朱俊访等[9]用本体聚合法制备延胡索乙素-MIPs，与延胡索乙素溶液相结合，其最大吸附容量为2.25 μmol/g，表现出较好的吸附效果。

磁性分子印迹技术以磁性分子印迹聚合物(Magnetic Molecularly Imprinted Polymers，MMIPs)作为固相萃取吸附剂,在外部磁场下直接提取复杂基质中的目标物，提高了吸附效率。朱安宏等[10]以Fe3O4磁性纳米颗粒为载体，成功制备了Que -MMIPs，可以实现Que的快速分离，该聚合物最大吸附容量为0.14 mg/g。但单纯磁性颗粒制备印迹材料仍存在分散性和吸附性不理想的问题[11]。本文使用聚乙二醇(PEG)对磁芯进行改性，增强了磁芯在致孔剂中的分散性，从而制备出尺寸均匀的磁性材料，提高了吸附性能。Feng等[12]采用PEG修饰的MMIPs测定酱油中的4-甲基咪唑啉，最大吸附容量达到0.8 μmol/L。PEG修饰的Que分子印迹方法尚未报道，故本研究采用PEG修饰方法制备Que -MMIPs，并对其进行表征以及吸附性能测定，结合固相萃取技术及高效液相色谱法(HPLC)完成对实际样品中Que含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

紫外-可见分光光度计(U-3010，日本日立)；高效液相色谱仪(Waters e2695 PAD-HPLC，美国沃特世)；固相萃取仪(ASPE-24，天津奥特赛思斯仪器有限公司)；红外光谱仪(Nicolet IS10，美国尼高力)；场发射透射电子显微镜(JEM2100F，日本JEOL)；场发射扫描电子显微镜(SU8020，日本日立)；振动样品磁强计(SQUID -VSM MPMS-3，美国Quantum Design公司)；脱色摇床(TS-A，晶玻实验仪器厂)；顶置式搅拌器(TS -20，上海安谱科技股份有限公司)；双数显恒温磁力搅拌器(HJ-2B，金坛市科析仪器有限公司)；数控超声波清洗器(KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司)。

槲皮素(Que)、丙烯酰胺(AM)、FeCl3·6H2O、芦丁(Rut)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，均购于阿拉丁试剂；甲基丙烯酸(MAA)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、偶氮二异丁腈(AIBN)购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；聚乙二醇(PEG)购于罗恩试剂；FeCl2·4H2O购于北京伊诺凯科技有限公司；NH3·H2O(25%)、冰乙酸、乙腈、甲醇、乙醇购于福晨(天津)化学试剂有限公司。实验用水为去离子水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters Sunfire C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为甲醇，B为质量分数0.1%的H3PO4水溶液；等度洗脱:比例50∶50；柱温:30 ℃；流速:1.0 mL/min；进样量:10 μL，检测波长:370 nm。

1.3 Que -MMIPs的制备

1.3.1 Fe3O4磁性纳米颗粒的制备参照共沉淀法[13]制备Fe3O4磁性纳米颗粒。具体步骤如下:将2 mol FeCl3·6H2O和1 mol FeCl2·4H2O溶于80 mL去离子水中，于300 r/min、60 ℃条件下搅拌30 min后，滴加40 mL NH3·H2O，立即出现黑色沉淀。升温至90 ℃继续搅拌1 h，上述反应过程均在N2氛围下进行。冷却至室温后，用外加磁场进行收集分离，将产物先后用去离子水和无水乙醇洗涤至中性，于60 ℃干燥后，得到黑色的Fe3O4磁性纳米颗粒。

1.3.2 Que -MMIPs的制备准确称取1 mmol Que和6 mmol AM溶于50 mL乙腈中，磁力搅拌12 h形成预聚合溶液。称取一定量的Fe3O4和PEG加至30 mL的去离子水中，超声乳化30 min。将上述溶液混匀，再加入30 mmol EGDMA和0.6 mmol的AIBN，超声20 min后，在N2氛围下进行搅拌，控制温度为60 ℃聚合24 h。反应完成后外加磁场分离提取，于60 ℃烘箱干燥，然后以甲醇∶乙酸(9∶1，V/V)混合溶液为提取溶剂进行索氏提取，直至紫外-可见分光光度计检测不到提取液中的Que为止，接着用甲醇索氏洗去乙酸，最后放入烘箱干燥。

磁性非分子印迹聚合物(Magnetic Non-molecularly Imprinted Polymers，MNIPs)的制备在合成步骤上与MMIPs相同，但不加模板分子。非磁性分子印迹聚合物(MIPs)和不加模板的非磁性分子印迹聚合物(Non-molecularly Imprinted Polymers，NIPs)除不加磁性乳液外，其余制备步骤均参照MMIPs和MNIPs的制备方法。

1.4 MMIPs和MNIPs的吸附性能

1.4.1 MMIPs和MNIPs的吸附容量试验(1)静态吸附等温线：在静态吸附实验中，用5 mL不同浓度(10～80 μmol/L)的Que甲醇溶液，分别与20 mg的MMIPs、MNIPs、MIPs和NIPs结合。于室温下振荡25 min后，用外加磁场分离聚合物，用0.22 μm微孔膜过滤。用紫外-可见分光光度计测定上清液中Que的含量，计算印迹聚合物对Que的吸附容量(Q)。(2)吸附动力学曲线：在吸附动力学实验中，分别将20 mg MMIPs和MNIPs加入到5 mL Que甲醇溶液(40 μmol/L)中。在室温下将混合物在5～45 min的不同时间间隔中孵育。随后用外加磁场将聚合物分离，经0.22 μm微孔膜过滤后，用紫外-可见分光光度计测定上清液中Que的浓度，计算Q(mg/g)。

1.4.2 MMIPs和MNIPs的吸附选择性试验通过比较聚合物对Que及其结构类似物Rut的吸附能力来评价其选择性[14]。分别将20 mg的MMIPs和MNIPs与5 mL(40 μmol/L)混合标准溶液在室温下振摇25 min后，外加磁场将上清液和聚合物分离过膜。用HPLC法测定上清液中Que和Rut的含量。按照上述方法测定MMIPs、MNIPs对不同底物的结合量，分别求出静态分配系数(Kd)及分离因子(α)，考察不同底物的吸附选择性。

1.5 分子印迹固相萃取(MISPE)小柱的制备

在5 mL聚丙烯固相萃取空柱中均匀填入100 mg制备的MMIPs，分别在聚合物上下加盖聚乙烯筛板，填充均匀，用玻璃棒轻轻压实，得到柱压适当的MISPE小柱。

1.6 MMIPs再生识别能力的测试

实验中为了测试MMIPs的稳定性和可重复使用性，在相同的实验条件下，每次将3 mL Que标准溶液(40 μmol/L)过MISPE小柱，分别经过淋洗、洗脱直至检测不出Que的含量，重复操作10次，测定MMIPs对Que标准溶液(40 μmol/L)的结合活性。

1.7 MMIPs对实际样品测定

1.7.1 样品前处理选取苹果皮[15]、西兰花、乌龙茶和沙棘粉作为实际样品进行含量测定。采用机械方法准备苹果皮、西蓝花、乌龙茶和沙棘粉，将他们在烘箱干燥后，分别准确称量5 g烘干后的样品，在80 ℃条件下用无水乙醇回流冷凝提取2 h，过滤去渣，滤液用旋转蒸发仪蒸至近干，然后用甲醇复溶至25 mL容量瓶中作为样品储备溶液，备用。

1.7.2 样品检测与方法验证配制0、50、100、500 μmol/L不同浓度的Que标准溶液，分别取 2 mL 不同浓度的标准溶液与1 mL的样品贮备溶液混溶，过MISPE小柱，得到3 mL滤液，用3 mL甲醇淋洗MISPE小柱，最后用3 mL的甲醇∶乙酸(9∶1,V/V)作为淋洗液进行6次洗脱，将标准溶液、样品储备溶液、滤液、淋洗液以及洗脱液分别用HPLC法测定，每个水平重复3次，计算平均检出量、平均加标回收率、标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)。

2 结果与讨论

2.1 模板分子与功能单体相互作用的研究

利用紫外-可见分光光度法测定不同浓度功能单体与定量的模板分子预聚物结合程度[16]。配制Que的浓度为1 mmol/L，选择AM作为功能单体，配制不同配比的混合预组装溶液，磁力搅拌12 h后，分别扫描300～450 nm范围内紫外吸收光谱，见图1。可以看出，随着AM的浓度增大，预聚合后溶液的吸光度降低，并且最大吸收波长发生红移，说明AM与Que发生了作用。这是由于AM是碱性的功能单体，而Que是多酚类的酸性化合物，含有较多的羟基，它们之间具有离子间作用；另外由于它们之间形成的氢键也使得相互之间发生作用，形成复合物。并且由于氮原子上的多余电子对Que芳香环的供电子基效应，使得AM最大吸收波长发生红移。因此，我们选择结合最佳的比例1∶6来制备印迹材料。

图1 不同比例AM预聚合的紫外吸收光谱图

2.2 MMIPs和MNIPs的表征

2.2.1 MMIPs和MNIPs的电镜表征图2分别为MMIPs和MNIPs的扫描电镜(SEM)图。由图A中可以看出MMIPs呈规则的团状聚合物，尺寸均匀，分散性好，聚合材料表面较为粗糙，说明模板分子已洗脱，适合作为固相萃取填料；而由B图中可以看出MNIPs呈现出条形状，表面较为光滑，尺寸杂乱，不适合作为特异性吸附材料。

图2 MMIPs(A)和MNIPs(B)的扫描电镜(SEM)图

图3分别为Fe3O4和MMIPs的透射电镜(TEM)图。从图3A中可以看出磁性粒子尺寸为纳米级，大小较为均匀，适合作为印迹材料的磁芯；而从图3B中可以看出深色磁芯外围包覆着颜色较浅的分子印迹聚合物，且存在一定的空间位点，证明成功地制备出了磁性分子印迹材料。

图3 Fe3O4(A)和MMIPs(B)的透射电镜(TEM)图

2.2.2 MMIPs和MNIPs的红外光谱表征图4是Fe3O4、MMIPs和MNIPs的红外光谱图。如图所示，Fe3O4在523 cm-1处的吸收带处出现明显的Fe-O键伸缩振动峰，MMIPs和MNIPs谱图中也在此位置出现峰形，证明Fe3O4被嵌入到聚合物中。3 500 cm-1处的峰是由AM的N-H拉伸引起的。MMIPs和MNIPs谱图中1 671 cm-1左右的峰是AM和EGDMA中C=C的伸缩振动峰。在MMIPs和MNIPs谱图中，C-O-C的伸缩振动峰为1 144 cm-1，再次表明MMIPs是由EGDMA交联而成。以上证明磁性分子印迹聚合物制备成功。

图4 MMIPs、MNIPs和Fe3O4的红外光谱图

2.2.3 MMIPs和MNIPs的磁性表征制备获得的MMIPs必须具有超顺磁特性，才能实现外加磁场的快速分离。因此，我们使用VSM来研究Fe3O4和MMIPs的磁性能。磁滞回线如图5所示，图上显示没有磁滞现象，结果表明Fe3O4和MMIPs具有超顺磁性。Fe3O4和MMIPs的饱和磁化率分别为58.78、26.68 emu/g。由于聚合物壳层在Fe3O4表面的屏蔽作用导致了Fe3O4的饱和磁化强度降低，且MMIPs的磁性能可以满足外加磁场快速分离的要求。

图5 Fe3O4和MMIPs的磁滞回归线

2.3 MMIPs和MNIPs的吸附性能

2.3.1 MMIPs和MNIPs的吸附容量研究了在室温下不同浓度的Que标准溶液与MMIPs、MNIPs、MIPs和NIPs结合的吸附等温线(图6)。结果表明，磁性材料比非磁性材料具有更多的结合位点，使其具有更好的吸附性能。当浓度小于70 μmol/L时，MMIPs的Q随浓度的增加而快速增加。当初始浓度超过70 μmol/L时，吸附曲线达到饱和，吸附逐渐趋于稳定。而MNIPs在Que初始浓度大于40 μmol/L时的Q已趋于饱和，并且在相同初始浓度下MMIPs的Q远大于MNIPs的Q，证明MMIPs对Que具有很好的吸附效果。在不同浓度下，MMIPs对Que的吸附能力和识别能力均显著高于MNIPs。这一发现可能与MMIPs特异印迹位点的存在有关。经计算，MMIPs与Que的饱和结合能力为4.38 mg/g，约为MNIPs(1.36 mg/g)的3.2倍。

图6 MIPs、NIPs、MMIPs和MNIPs对Que的吸附等温线

在分析MMIPs的吸附性能时，常用Scathard模型来评价其结合特性和结合位点的个数。Scathard的方程式为:Q/ce=(Qmax-Q)/Kd。式中，Kd为结合位点的平衡离解常数，Qmax代表结合位点的最大表观结合量，ce表示底物在上清液中的平衡浓度。以Q/ce对Q作图，可以得到聚合物的平衡离解常数Kd及结合位点的最大表观结合量Qmax。

对上述吸附实验结果进行Scatchard分析。图7为Scathard分析曲线。从图可知MMIPs的Scatchard曲线呈现良好的线性，线性方程为：y=-2168.4x+8597.4，线性相关系数R2=0.993。结合位点离解常数Kd=0.46 mg/L，结合位点的最大表观结合量约为Qmax=3.96 mg/g。说明在所研究的浓度范围内，聚合物主要形成一种结合位点。原因可能是在聚合过程中Que的酚羟基与AM上的氮原子通过较强的氢键和离子键作用形成了组成相同的复合物，且具有等价的结合位点。

图7 Scathard分析曲线

由图8可知，MMIPs的Q要高于MNIPs的Q，并且随着吸附时间的延长，吸附量逐渐增大，吸附速率逐渐减小，当吸附时间达到25 min时，吸附量基本保持恒定不变，最终吸附趋于平衡。因此25 min为最佳饱和吸附时间，并以此作为后续实验吸附时间。

图8 MMIPs和MNIPs对槲皮素的吸附动力学曲线

2.3.2 MMIPs和MNIPs的吸附选择性由表1可知，MMIPs对Que和Rut的Kd分别为4.80和1.18，分离因子α=4.05；而MNIPs对Que和Rut的Kd分别为2.41和1.62，分离因子α=1.49。说明MMIPs对Que具有较好的选择性，其原因是MMIPs的模板分子为Que，能够特异性识别Que并对其有选择性地保留，而印迹材料对Rut没有明显的特异性吸附。

2.4 MMIPs的再生识别能力测试

从图9中可以看出，MMIPs可以重复使用至少10次，且对Que的吸附能力没有明显下降，从第5次开始吸附容量出现轻微的下降。结果表明MMIPs在实际应用中具有良好的稳定性和重复使用性。

图9 MMIPs的重复性试验

2.5 MMIPs对实际样品的吸附测定

2.5.1 标准曲线与检出限配制1 mmol/L Que甲醇标准储备溶液，分别稀释为0、50、100、200、400、600、800 μmol/L的标准溶液，结合HPLC法测得Que在3～800 μmol/L范围内，其峰面积与浓度呈良好的线性关系。线性相关系数R2=0.9990。检出限(S/N=3)为0.9 μmol/L。

2.5.2 样品加标回收试验实验中对“1.7”中的4种样品储备溶液过膜进行检测，其中在沙棘粉中测得Que的平均检出量为57 μmol/L，而苹果皮、西兰花以及乌龙茶3种样品与Que标准溶液峰形进行比较未发现Que的特征峰，3种样品中Que含量均未在检出限以上，因此采用加标回收试验来进行方法学验证。结果见表1，Que回收率在90%～114%之间，相对标准偏差(RSD)在1.11%～5.7%范围，表明发展的方法能够有效地检测样品中的Que含量。

表1 3种样品中槲皮素的加标回收率(n=3)

3 结论

成功制备了槲皮素磁性分子印迹聚合物(Que-MMIPs)，其最大吸附容量为4.38 mg/g ，最佳吸附时间为25 min。与结构类似物芦丁吸附效果对比，其表现出较好的特异性吸附，分离因子为4.05。在实际样品测定中，测得富集后沙棘粉中槲皮素的含量为57 μmol/L ，加标样品的回收率为90%～114%，表明PEG修饰后的Que-MMIPs吸附性能良好，特异性识别能力较强，故本研究对天然药物活性成分在复杂基质中的分离纯化具有重要参考意义。