磁性共价有机框架材料吸附分离卵清蛋白

何荣桓， 王佳怡, 郭鹏飞, 陈明丽

(东北大学理学院化学系,辽宁沈阳 110819)

蛋白质作为生命的物质基础，是生命活动的重要承担者，其对生命体中的代谢催化、物质转运、协调运动以及生长与发育的控制均发挥着非常重要的作用[1]。将蛋白质从复杂生命体中分离出来，并进行后续的结构及功能研究，对于理解生命活动的规律和阐明生命现象的本质具有重要意义。固相萃取是蛋白质分离富集的重要手段，其操作简单快速，吸附分离效率高[2]。因此，发展新型有效的固相萃取材料，是蛋白质分离富集研究领域的重要内容。

众所周知，多孔材料具有较大的比表面积，固有的孔隙率和丰富的合成后修饰结合位点，使其成为吸附蛋白质及其他物种的有效候选材料。其中共价有机框架(COFs)作为一种具有强共价键的新型晶体有机聚合物，自被报道以来引发了大量相关研究[3]。COFs的特定结构使其具有显著特点，即孔道规整、易于官能团化、合成单体广泛、连接方式多样化、性质稳定等[4]。灵活多样的功能化及物理化学性能调控，使其在蛋白质的分离富集领域具有广阔的应用前景。研究发现COFs难以从溶液中快速分离出来，从而影响其在实际固相萃取中的分离富集效率，而磁性纳米载体则可有效地解决其相分离的问题[5]。本文采用超声合成法，在常温常压下制备了一种可在溶液条件下稳定存在的亚胺型COFs载体[6]。将COFs负载于Fe3O4表面，得到了一种磁性Fe3O4@COF复合材料。其中，具有超顺磁性的Fe3O4磁性纳米粒子可快速对外界磁场产生响应，从而提高吸附分离与富集效率。在pH=5及离子强度为0.4 mol/L NaCl溶液的条件下，Fe3O4@COF复合材料可有效吸附卵清蛋白，并具有较高的吸附容量。将其应用于蛋清中卵清蛋白(Ovalbumin,Ova)的分离富集与纯化，得到了满意的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DYCZ-24DN迷你双垂直电泳槽、双垂直电泳仪DYCZ-24EN电泳槽、DYY-26C电泳仪电源和钟摆式脱色摇床(北京六一生物科技有限公司)；ZEISS Ultra/Plus型扫描电子显微镜(德国，ZEISS公司)；Oxford X-MaxN 50 EDS能谱分析仪(英国，Oxford公司)；Tanon 4600 SF全自动数码凝胶图像分析仪(上海天能科技有限公司)；U-3900型紫外-可见分光光度计(日本，Hitachi公司)；Nicolet-6700傅里叶变换红外光谱仪(美国，赛默飞公司)；Nano-ZS90激光粒度仪(英国，Malvern公司)。

三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸(大连美仑生物公司)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甲醇、四氢呋喃、十二烷基硫酸钠(SDS)和过硫酸铵(上海阿拉丁试剂有限公司)；柠檬酸钠(天津博迪化工有限公司)；无水NaAc、咪唑、乙二醇、HCl、H3PO4、TEMED(国药集团化学试剂有限公司)；柠檬酸三钠、NaCl、FeCl3、冰HAc(天津大茂化学试剂厂)；联苯胺(北京市东环联合化工厂)；1,4-二氧六环、1,3,5-三甲基苯、丙酮(沈阳莱博科贸有限公司)；考马斯亮蓝G250(上海博奥试剂有限公司)。水为去离子水。

1.2 磁性复合材料的制备

1.2.1 Fe3O4的水热法合成采用文献方法[7]合成Fe3O4，具体步骤如下：将FeCl3(1.4 g)与柠檬酸钠(0.4 g)及NaAc(3.8 g)溶解于70 mL乙二醇中，超声10 min分散均匀，然后在80 ℃下机械搅拌1 h，将所得混合物转移至聚四氟乙烯反应釜中在200 ℃反应16 h。反应结束后将混合物冷却至室温，依次用去离子水和乙醇洗涤合成产物3次，将所得固体在60 ℃真空干燥8 h,即得Fe3O4。

1.2.2 Fe3O4@COF复合物的超声法制备在文献方法[8]的基础上，采用超声法制备Fe3O4@COF复合材料，具体步骤为：将Fe3O4(150 mg)、1,3,5-三甲酰基间苯三酚(21 mg)、联苯胺(27 mg)分散于3 mL二氧六环、3 mL均三甲苯及0.5 mL(3 mol/L)HAc的混合溶剂中，超声1 h后，加入40 mL四氢呋喃，继续超声30 min。然后浸泡24 h，将所得产物用DMF和丙酮依次清洗3次，将所得复合材料在65 ℃真空干燥10 h，即得Fe3O4@COF。

1.3 Fe3O4@COF复合物对蛋白质的吸附性能研究

1.3.1 pH值及离子强度的影响称取1 mg Fe3O4@COF，置于1.5 mL离心管中，向其中加入1 mL 100 μg/mL的卵清蛋白溶液(分别用pH=3、4、5、7、9的缓冲溶液配制)，吸附时间设定为30 min。吸附后，测定不同pH值条件下的吸附率。

向100 μg/mL卵清蛋白溶液(pH=5.0)中加入不同浓度NaCl溶液，与1 mg Fe3O4@COF复合物振荡吸附30 min，吸附结束后进行磁性分离，测定不同NaCl浓度下的吸附率。

1.3.2 吸附容量的测定在最佳pH和离子强度条件下，将1 mg的Fe3O4@COF复合材料，分别加入50、100、200、400、800、1 000 μg/mL的卵清蛋白溶液中进行吸附实验。吸附结束后，按照下列公式计算Fe3O4@COF 复合物对不同初始浓度卵清蛋白的吸附量(Q)。

(1)

式中，c0为吸附溶液初始浓度；c1为平衡后吸附上清液的浓度；V为吸附溶液体积；m为固体吸附剂质量。

1.3.3 卵清蛋白的洗脱与回收为了有效洗脱与回收吸附在Fe3O4@COF复合物表面的卵清蛋白，对可能的洗脱剂进行了选择预实验。分别选择0.1%的SDS、0.1 mol/L的Tris和0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH=5)作为洗脱剂，在最佳吸附条件下对卵清蛋白进行吸附后，移除上清液，并分别加入1 mL 以上洗脱剂，将洗脱时间设定为30 min进行洗脱回收，测定洗脱回收率。

1.4 实际样品中卵清蛋白的洗脱回收

取新鲜鸡蛋清10 μL，用0.4 mol/L的缓冲溶液(pH=5.0)稀释100倍，经5 000 r/min离心除去杂质。移取1 mg Fe3O4@COF复合材料，向其中加入1 mL蛋清稀释溶液，振荡吸附30 min后，磁分离。取上清液加入1 mL 0.1%SDS溶液，振荡30 min以洗脱吸附的卵清蛋白，得到纯化的卵清蛋白溶液，并对其进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4@COF复合材料的表征

2.1.1 化学结构分析红外光谱分析的结果表明，位于630 cm-1和1 612 cm-1的吸收峰分别对应Fe3O4中的Fe-O伸缩振动[9]及其表面残留的-COOH；3 425 cm-1对应H-O-H的非对称伸缩振动峰,是由于Fe3O4中残留的水分引起的。在Fe3O4@COF复合材料中,630 cm-1的峰强度相比于Fe3O4明显减小，证明Fe3O4被成功包覆。另外，在1 586 cm-1和1 452 cm-1处出现的新吸收峰为苯环的呼吸特征峰，而1 288 cm-1及1 091 cm-1为C-N和C-O等单键的伸缩振动峰，997 cm-1及816 cm-1为烯烃面外弯曲振动峰。上述实验事实说明COFs已被固载于Fe3O4粒子表面。

2.1.2 形貌与元素分析图1A和1B中Fe3O4和Fe3O4@COF复合材料的扫描电子显微镜(SEM)图显示其均为球形且单一分散。另外，通过对比Fe3O4和Fe3O4@COF的形貌,可以发现在修饰COFs之前,Fe3O4表面相对平整，而由于修饰COFs导致其表面变得粗糙不平，出现了许多突起，证明了COFs已成功包裹于Fe3O4表面。图1C和1D中的能谱(EDS)给出了Fe3O4以及Fe3O4@COF中的元素分析结果，显而易见，与Fe3O4相比，Fe3O4@COF表面出现了非常明显的C元素和N元素峰，此结果可进一步说明COFs已固载/包裹于Fe3O4的表面。

图1 (A)Fe3O4的扫描电镜(SEM)图；(B)Fe3O4@COF的SEM图；(C)Fe3O4的EDS能谱(EDS)图；(D)Fe3O4@-COF的EDS谱图

2.1.3 表面电荷性能分析Zeta电位是带电固体与液体介质相对运动时,实际运动界面与液体内部的电位差。由于颗粒表面带电,可通过库仑力与其他作用力吸引周围带有相反电荷的离子构成紧密层。在紧密层之外,溶液中的正负离子由于静电排斥和热运动而形成扩散层,紧密层与扩散层则构成双电层。固体颗粒表面吸附的水分子膜与水化分子构成固定层，与双电层之间形成剪切面，剪切面相对于电介质本体处的电位差即为Zeta电位，其可以有效的表明固体表面的电荷性能。由图2可知，Fe3O4和Fe3O4@COF在pH=3～9的范围内表面均带负电，并且在修饰COFs后，由于材料表面苯环、C-N以及C=C等官能团的比例增加，使得Fe3O4@COF复合材料相较于Fe3O4电负性减弱。这表明修饰COFs后，材料表面性能得到了明显改变。

图2 Fe3O4和Fe3O4@COF复合物表面的Zeta电位变化趋势图

2.2 Fe3O4@COF复合材料对卵清蛋白的吸附性能

2.2.1 pH对卵清蛋白吸附的影响不同pH条件下，Fe3O4@COF复合材料对卵清蛋白的吸附情况如图3所示。随着溶液pH增大(pH=3～5)，卵清蛋白的吸附增加，在pH=5时吸附率最高。随pH继续增加(pH=5～9),卵清蛋白的吸附效率降低。卵清蛋白是一种糖蛋白[10],其等电点为pI=4.5,在其天冬酰胺残基的位置上与一个由3个N-乙酰葡糖胺、5个甘露糖残基组成的寡糖形成溶剂暴露的N-糖苷键[11]。所以卵清蛋白中含有寡糖链，表面存在较多羟基，可与COFs中的O、N等原子形成氢键。随pH增大，卵清蛋白表面羟基质子化的程度变弱，导致以氢键结合形式吸附的蛋白质增加；同时，在pH=3～4.5时，卵清蛋白表面带正电荷，其与Fe3O4@COF复合材料发生静电吸引而被吸附到Fe3O4@COF载体上。当pH>5时，卵清蛋白表面失去质子带有负电荷，因此导致静电吸附效率降低。

图3 pH对卵清蛋白在Fe3O4@COF复合物表面吸附效率的影响

2.2.2 离子强度对卵清蛋白吸附的影响通过研究pH对Fe3O4@COF复合物吸附卵清蛋白的影响可知,氢键与静电作用是该复合物吸附卵清蛋白的主要驱动力。为此，选择pH=5.0，考察离子强度变化对Fe3O4@COF复合材料吸附卵清蛋白的影响，离子强度的变化通过改变溶液中NaCl的浓度予以实现。如图4所示，在离子强度较低时(<0.4 mol/L)，随NaCl浓度增大，卵清蛋白的吸附效率增加。这可能是由于NaCl浓度增大导致离子的水化作用增强而使水分子离开蛋白，蛋白质裸露出来致使吸附载体的结合增强，从而导致吸附效率出现增高的趋势。随着离子强度继续增大(>0.4 mol/L),吸附率开始下降，溶液中高浓度的NaCl与蛋白质在Fe3O4@COF复合材料表面的竞争吸附作用增强，导致吸附效率呈现下降的趋势。

图4 离子强度对卵清蛋白在Fe3O4@COF复合物表面吸附效率的影响(pH-5.0)

2.2.3 吸附容量研究表明，随着卵清蛋白浓度增大,Fe3O4@COF复合材料对其吸附量逐渐增大，这是由于在蛋白质浓度较低时,Fe3O4@COF复合材料具备充足的吸附位点，可吸附溶液中所有的蛋白质。而当蛋白质浓度增加到一定程度时，随着蛋白质初始浓度的增大，其吸附的增加趋势变缓，直至达到平台区。根据卵清蛋白的吸附等温线，由1/Qe对1/ce的线性关系(ce和Qe分别为液相及固相中蛋白质的浓度),得到拟合线性方程：1/Qe=0.05857/ce+0.00227。说明Fe3O4@COF复合材料对卵清蛋白的吸附行为符合Langmuir等温式吸附，并可判断Fe3O4@COF复合物对卵清蛋白的吸附为单分子层吸附。同时得到吸附容量Qmax为440.5 μg/mg。

2.2.4 卵清蛋白的洗脱与回收卵清蛋白被Fe3O4@-COF复合材料吸附后，需要将其洗脱并回收，转入水相中以利于后续的研究。为此，我们考察了3种常用洗脱剂对卵清蛋白的洗脱与回收效果。洗脱剂分别为SDS(0.1%)、Tris(0.1 mol/L)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH=5)。实验结果表明，这些洗脱剂均可一定程度的从Fe3O4@COF复合材料上洗脱回收卵清蛋白，其中0.1%SDS和0.1 mol/L Tri的洗脱效果更佳，其对卵清蛋白的洗脱回收效率分别为84%和95%。

2.3 实际样品中卵清蛋白的吸附分离

按照前述实验方法和条件，将Fe3O4@COF复合材料应用于鸡蛋清中卵清蛋白的分离与纯化，经SDS-PAGE分析的结果如图5所示。很显然，经吸附分离后从蛋清样品中得到6.5～200 kDa范围内的几条明显的条带(泳道b)，分别对应样品中的伴白蛋白(77.7 kDa)、卵清蛋白(45 kDa)以及溶菌酶(14.3 kDa)。经过Fe3O4@COF复合材料吸附分离后，在上清液中这些条带依然清晰地存在，只是条带的颜色变浅(泳道c)。这是由于样品中这些蛋白的浓度很高，1 mg Fe3O4@COF复合材料吸附后只能去除一部分，但是不可能完全吸附。而经0.1%SDS洗脱后，洗脱液在44.3 kDa处有一个明显条带(泳道d),该条带与卵清蛋白条带位置一致(泳道e)，这是洗脱回收得到的卵清蛋白。该条带还有一条伴生条带，这是由于卵清蛋白属于球状蛋白,其在某一pH和盐浓度条件下可以形成两种微结构所致[12]。

图5 有关样品及洗脱液中蛋白质的SDS -聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳谱图。(a)蛋白Marker(kDa)；(b)100倍稀释的蛋清液；(c)100倍稀释的蛋清液经Fe3O4@COF复合物吸附后的上清液；(d)经Fe3O4@COF复合物吸附后又经0.1%SDS洗脱回收的卵清蛋白溶液；(e)卵清蛋白标准溶液(100 μg/mL)。

3 结论

本文采用超声合成法制备了一种磁性Fe3O4@COF复合材料。结果表明，Fe3O4@COF复合材料为球形形貌，且具有良好的单分散性且其粒径均一。Fe3O4@COF复合材料在一定条件下可以有效地吸附分离卵清蛋白。蛋清中的卵清蛋白被Fe3O4@COF复合材料吸附后，还可以方便地用0.1%的SDS或0.1 mol/L的Tris缓冲溶液进行有效地洗脱回收。说明磁性共价有机框架复合材料可作为蛋白质分离富集新的吸附载体，可据以设计并调控对特定蛋白质的吸附与分离。