通过式固相萃取-液相色谱-串联质谱法快速测定中兽药制剂中硝基呋喃类药物

宋 军， 艾连峰， 王 敬， 张海超*， 霍惠玲， 李研东

(1.河北省林草花卉质量检验检测技术中心，河北石家庄 050017；2.石家庄海关技术中心，河北石家庄 050051；3.河北省兽药监察所，河北石家庄 050035)

在我国畜牧业持续发展的进程中，中兽药制剂因其毒副作用小、价格低廉一直备受青睐。然而，近年来中兽药制剂中经常检出一些禁限用化学药物，严重干扰了兽药市场秩序，也给动物产品质量带来安全隐患[1]。硝基呋喃类药物是一类具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗生素，主要有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，因其价格低廉疗效好曾被广泛用于养殖业，以治疗由大肠杆菌和沙门氏菌引起的疾病。但由于该类药物及代谢物对人体有致癌、致畸胎等副作用，相继被世界各国规定在饲养过程中禁止使用，并将硝基呋喃代谢物作为非法使用硝基呋喃的残留标志物，而欧盟设定4个硝基呋喃代谢物的最低方法检测限均为1 μg/kg[2]。有研究表明，低至30 μg/kg的硝基呋喃类药物也会造成动物源性食品的污染[3]。为从源头上确保动物源性食品安全，我国农业部将硝基呋喃类药物列为兽药质量监督抽检中的重点检测项目，但农业部2448号公告及现有文献报道中兽药制剂中硝基呋喃药物测定低限为2 mg/kg[4]，难以满足监管需求。因此，建立一种测定中兽药制剂中硝基呋喃类药物的快速、高灵敏度的分析方法，对于打击违法添加、保障中兽药制剂质量具有实际意义。

硝基呋喃类药物的检测方法主要有液相色谱法[4 - 8]和液相色谱-串联质谱法[4,9 - 11]，涉及的基质多为饲料[4,7]和动物源性食品[6,8]。中兽药制剂采用液相色谱法检测易受基质影响，不能准确定性定量，局限性较大。液相色谱-串联质谱法作为一种灵敏度高，抗干扰能力强的分析手段，对于硝基呋喃类药物的测定具有明显的优势。现已报道兽药制剂非处方药物的测定方法中多未经过净化，提取液直接上机测定[12 - 15]。但中兽药制剂配方中通常含有多种中药成分，在生产中需经过煎煮、蒸馏、添加辅料等制作工艺，基质复杂，严重影响了方法的灵敏度和抗干扰性。且提取液不经净化上机易污染色谱柱和仪器，增加维护成本。因此，选择合适的前处理净化方法显得尤为重要。PRiME HLB是一种新型的通过式固相萃取柱，操作简便快速，净化效果好，目前已被广泛应用于动物源性和植物源性基质的净化[16 - 20]，但在中兽药制剂中的应用还未见报道。

本文选取清瘟败毒散、静呼素和麻杏石甘口服液三种中兽药制剂为代表性基质样品，重点对提取溶剂、净化方式的选择以及色谱条件的优化进行了研究论证。最终采用PRiME HLB柱净化，建立了中兽药制剂中硝基呋喃类药物的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)，该方法操作简单，净化效果好，适用于大批量中兽药制剂中硝基呋喃类药物的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

8050液相色谱-串联质谱仪(日本，岛津公司)；KQ-500E超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；Sigma 3K-15型离心机(美国，Sigma公司)；PT2100型均质器(瑞士，KINEMATICA公司)；涡旋混合器(美国，Scientific Industries)；混合型阳离子(MCX)固相萃取柱(150 mg/6mL，美国Waters公司)；亲水亲脂型(HLB)固相萃取柱(150 mg/6mL，美国Waters公司)；PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6mL，美国Waters公司)。

标准品：呋喃它酮(Furaltadone,FTD)、呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)、呋喃妥因(Nitrofurantoin,NFT)、呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ)，均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于97%。色谱纯乙腈、甲醇、丙酮购自飞世尔试剂公司(美国赛默飞)。分析纯NaCl购自国药集团化学试剂有限公司。实验所用纯水均由美国Milli-Q纯水系统(美国，Millipore公司)制得。

1.2 混合标准溶液的配制

分别称取4种硝基呋喃类药物标准品各10.0 mg(折合纯度后)，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到质量浓度为1 mg/mL的单标储备溶液，于4 ℃下避光保存。根据需要，准确移取适量各硝基呋喃标准储备溶液，用甲醇稀释成混合标准工作溶液，待用。

1.3 样品前处理

称取4 g(精确到0.01 g)混合均匀的试样，置于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈涡旋混匀1 min，加入2 g NaCl，超声提取20 min，在10 000 r/min下离心5 min。上清液待净化。

将PRiME HLB固相萃取柱置于固相萃取装置上，取适量上清液于固相萃取柱中，收集5 mL流出液于玻璃试管中，在40 ℃下氮吹至近干，加入甲醇-0.1%甲酸溶液(2∶8，V/V)涡旋混匀30 s溶解残渣后，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.4 分析条件

色谱条件：Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A为水，B为甲醇；流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%B；0.5～4.0 min，10%～90%B；4.0～5.0 min，90%B；5.0～5.1 min，90%～10%B；5.1～7.0 min，10%B。柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正负离子同时扫描，采用多反应监测(MRM)模式检测，离子源温度300 ℃，毛细管温度250 ℃，加热模块温度400 ℃，氮气流速3.0 L/min，干燥气流速10.0 L/min，加热气流速10.0 L/min。质谱参数见表1。

表1 4种硝基呋喃类药物的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

中兽药制剂成分复杂，参考文献方法，本文对乙腈[7]、乙酸乙酯[6]、乙腈-0.1%甲酸溶液(8∶2，V/V)[5]和甲醇-乙腈-水溶液(3∶3∶4，V/V)[11]4种提取溶剂进行了比较。以静呼素(主要成分为溶菌酶，载体为鱼腥草、知母、泽泻、莱菔子、甘草等)为例，4种目标物回收率见表2。同时发现不同提取溶剂对基质效应的影响很大，4种提取溶剂提取10 ng/mL FTD的基质加标如图1所示。从图中可看出甲醇-乙腈-水溶液(3∶3∶4，V/V/V)提取的杂质最多，严重抑制了化合物的离子化效率，甚至导致FTD信噪比小于10，无法准确定量。其余3种提取溶剂中乙腈和乙酸乙酯提取的杂质最少，乙腈-0.1%甲酸溶液(8∶2，V/V)其次，推测水相的增加会提取更多杂质，导致提取效率下降。综合考虑，从提取更多目标化合物和更少杂质的角度出发，本文选择乙腈作为提取溶剂，4个目标物的回收率均超过80%。

表2 4种提取溶剂对回收率的影响

图1 不同提取溶剂对呋喃它酮基质干扰的影响

2.2 净化方式的选择

硝基呋喃原药通常采用HLB[10,11]和MCX[5,7,8]固相萃取柱净化。本研究首先考察了这2种固相萃取柱对4种目标物加标回收率的影响。结果发现采用MCX柱净化，只有FZD的回收率可以达到80%，NFT和NFZ的回收率在50%左右，FTD的回收率仅为30%。而采用HLB净化，4个化合物回收率均可达到70%以上。但考虑到HLB固相萃取柱需要经过溶剂转换、活化、淋洗等步骤，操作复杂耗时长。而采用PRiME HLB净化，回收率也均在70%以上，且该净化方式提取液可直接上样，无需氮吹转化溶液，故最终选用PRiME HLB柱净化。与传统HLB固相萃取方式相比，本研究整个净化过程操作简便，净化效果好，适合同时处理大批量样品。

2.3 色谱条件的优化

在流动相的选择中考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-5 mmol/L NH4Ac溶液和甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L NH4Ac溶液4种流动相对目标物的影响。结果表明，甲醇比乙腈更有助于提高FZD的响应值。在水中加入NH4Ac后4个化合物的灵敏度都偏低，再加入0.1%甲酸仍无改善，所以流动相选为甲醇-水。但在定容液中加入适量甲酸后对NFT和NFZ的灵敏度略有提高，且对其他两种物质干扰极小，因此选用了甲醇-0.1%甲酸溶液(2∶8,V/V)作为本实验的定容液。4种硝基呋喃类药物的定量离子色谱图如图2所示。

图2 4种硝基呋喃药物混合标准溶液的定量离子色谱图

2.4 基质效应

采用液相色谱-串联质谱法对基质复杂的中兽药制剂样品进行测定时，基质效应对定量结果往往存在着较大影响。本文采用空白基质溶液配制的标准曲线与纯溶剂配制的标准曲线进行斜率比较来评价基质效应。斜率比为0.8～1.2时，表示基质干扰程度较低；斜率比为0.5～0.8或1.2～1.5时，表示有中等强度的基质干扰效应；当斜率比值小于0.2或大于1.5时，表示基质效应干扰强[21]。结果表明，所选中兽药基质对NFT的基质效应影响较小，基质效应值为0.9～1.1，对其余3种化合物均中等强度的基质抑制效应，基质效应值在0.5～0.8之间。因此为降低基质效应的影响，本研究采用空白基质匹配标准曲线进行定量分析。

2.5 方法学评价

2.5.1 线性关系、检出限和定量限将清瘟败毒散、静呼素、麻杏石甘口服液三种兽药制剂的阴性空白样品提取溶液制备系列浓度基质匹配混合标准溶液，采用本方法进行分析测定。以目标物浓度(x，ng/mL)为横坐标，以对应的离子峰面积(y)为纵坐标绘制基质匹配标准曲线，外标法定量。各组分在相应线性范围内，峰面积与浓度成良好的线性关系，相关系数(r)为0.9958～0.9993，在空白基质中添加不同质量浓度的待测物，计算方法的检出限(S/N>3)和定量限(S/N>10)，呋喃它酮检出限为0.4 μg/kg，定量限为为1 μg/kg，呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林的检出限均为4 μg/kg，定量限为10 μg/kg。各样品基质的线性方程和相关系数见表3。

表3 不同基质中4种呋喃原药的线性范围、线性方程和相关系数

(续表3)

2.5.2 回收率和精密度将清瘟败毒散、静呼素、麻杏石甘口服液的阴性样品进行加标回收试验，每种基质分别添加1倍、2倍和10倍定量限3个浓度，每个浓度设置6个平行。计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明，3种基质中各目标物的回收率在72.6%～109.7%之间，RSD在3.5%～10.3%范围。各化合物在静呼素样品及加标回收样品中定量离子色谱图如图3所示。各样品基质加标回收结果见表4。

图3 静呼素样品(a)和添加硝基呋喃类药物(b)的定量离子色谱图

表4 4种硝基呋喃类药物加标的平均回收率和相对标准偏差(n=6)

(续表4)

2.6 实际样品的测定

为评价该方法的有效性，本实验测定随机送检的止疟散、清瘟败毒散等20份中兽药制剂样品进行检测，结果均为阴性。

3 结论

本方法应用PRiME HLB固相萃取柱净化，以高效液相色谱-串联质谱法为检测技术，建立了中兽药制剂中4种硝基呋喃类药物的检测方法。本方法与传统净化方式相比，简化了前处理过程、提高了工作效率。该方法适用于大批量中兽药制剂中4种硝基呋喃类药物的测定。