反复妊娠失败并发遗传性易栓症患者外周血NK细胞百分数及其杀伤活性与妊娠结局的关系分析

刘兰云，吴正中，刘敏莉，连旭波

广东省深圳市龙岗区妇幼保健院产科，广东深圳 518700

反复妊娠失败（RRF）主要是指复发性流产以及反复种植失败[1-2]，该病的发生和凝血基因异常密切相关，大部分凝血基因异常患者由于无典型临床症状而无法被及时检出，然而在异常基因载体暴露于另一危险因素时，不良妊娠结局风险随之增加[3]。相对于孕妇而言，胚胎属于一种半同种异体移植，孕妇免疫系统是否能有效识别并耐受胚胎抗原，对妊娠建立和维持具有直接影响作用， 其中母-胎界面更是妊娠建立以及维持关键性部位。 自然杀伤细胞（NK）于妊娠免疫调控中起着至关重要的作用，其中外周血NK 细胞具有一定的杀伤活性，可发挥较为理想的抗病毒以及抗肿瘤活性，可能参与了妊娠过程[4-5]。鉴于此，该文选取该院2017 年1 月—2020 年12 月收治的85 例RRF并发IT 患者为研究对象， 研究外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性与妊娠结局的关系，以期为该病的诊治提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院收治的85 例RRF 并发IT 患者纳入研究。对所有受试者均进行为期12 周的随访观察，将其按照妊娠结局分为流产组41 例和正常妊娠组44 例。其中，流产组年龄26～44 岁，平均（36.45±6.12）岁；体质指数（BMI）20～31 kg/m2，平均（24.98±3.56）kg/m2；疾病类型：复发性流产30 例，反复种植失败11 例。正常妊娠组年龄25～45 岁，平均（37.41±6.55）岁；BMI19～30 kg/m2，平均（24.93±4.12）kg/m2；疾病类型：复发性流产34 例，反复种植失败10 例。 两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准[6]：①均经临床相关诊断确诊为复发性流产或反复种植失败；②均并发IT；③年龄在25～45岁之间；④临床病历资料完整。排除标准：①夫妇存在染色体异常者；②排卵异常或（和）月经异常者；③对抗凝药物过敏者；④伴有子宫畸形、子宫肌瘤或宫腔粘连等疾病者；⑤合并严重感染性疾病或自身免疫性疾病者；⑥合并恶性肿瘤者；⑦神志异常或合并精神疾病者；⑧正参与其他研究者。 入组人员均于同意书上签字，医院伦理委员会知悉并批准。

1.2 方法

①外周血NK 细胞百分数测定：选择在所有受试者孕前及孕期每2 周时， 获取肘静脉血3 mL， 通过EDTA-K2 抗凝处理。分离获取PBMCs 采用PBS 重复2 次洗涤处理。取100 μl 的PBMCs 加入含有1%胎牛血清以及0.09%叠氮钠的PBS 液中重复2 次洗涤处理。分别取CD3-FITC、CD45-Percip 以及CD16/CE56-PE 加入其中完成染色处理。 之后继续滴加250 μl 的Cytofix/Cytoperm 细胞固定/通透也实施固定、 通透处理。 最后以FASC Calibur 流式细胞仪（购自美国BD公司）完成免疫荧光和四色流式细胞分析。 ②外周血NK 细胞杀伤活性测定： 选择在所有受试者孕前及孕期每2 周时，获取肘静脉血3 mL，通过EDTA-K2 抗凝处理。 取处于对数生长期的K562 以及处理完成的PBMCs 混合，两者比例为50:1。 放置在37℃、5%二氧化碳条件下实施时长120 min 的孵育处理。 检测前15 min 取碘化丙啶完成凋亡细胞的标记。 最后借助FASC Calibur 流式细胞仪完成检测和分析。 并通过K562 细胞凋亡率实现对NK 细胞杀伤活性的反映。

1.3 观察指标

比较两组不同孕周外周血NK 细胞百分数以及外周血NK 细胞杀伤活性的差异。 分析RRF 并发IT患者外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性与流产的相关性。

1.4 统计方法

采用SPSS 24.0 统计学软件处理数据，计量资料以（±s）表示，组间差异比较采用t 检验；采用Spearman 相关性分析明确RRF 并发IT 患者外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性与流产的关系。 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同孕周外周血NK 细胞百分数评价比较

流产组孕0 周、孕6 周的外周血NK 细胞百分数均高于正常妊娠组，差异有统计学意义（P<0.05）；而两组孕8 周、 孕12 周时的外周血NK 细胞百分数对比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组患者不同孕周外周血NK 细胞百分数评价比较[（±s），%]

表1 两组患者不同孕周外周血NK 细胞百分数评价比较[（±s），%]

组别孕0 周孕6 周孕8 周孕12 周流产组（n=41）正常妊娠组（n=44）t 值P 值13.02±1.33 8.15±1.01 19.092<0.001 13.74±1.28 8.36±1.06 21.162<0.001 10.30±1.15 9.74±1.21 1.794 0.077 9.84±1.10 9.56±1.12 1.162 0.249

2.2 两组不同孕周外周血NK 细胞杀伤活性评价

流产组孕0 周、孕6 周的外周血NK 细胞杀伤活性均高于正常妊娠组，差异有统计学意义（P<0.05）；孕8 周、孕12 周时对比,差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组患者不同孕周外周血NK 细胞杀伤活性评价比较（±s）

表2 两组患者不同孕周外周血NK 细胞杀伤活性评价比较（±s）

组别孕0 周孕6 周孕8 周孕12 周流产组（n=41）正常妊娠组（n=44）t 值P 值19.12±3.94 15.03±2.17 5.982<0.001 17.42±3.11 13.49±2.04 6.934<0.001 14.13±2.10 13.55±2.14 1.260＞0.05 14.05±2.08 13.61±2.11 0.967＞0.05

2.3 RRF 并发IT 患者外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性与流产的相关性分析

经Spearman 相关性分析可得，RRF 并发IT 患者孕0 周、 孕6 周的外周血NK 细胞百分数、 外周血NK 细胞杀伤活性均和流产呈正相关关系（P<0.05），见表3。

表3 RRF 并发IT 患者外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性与流产的相关性分析

3 讨论

研究表明，妊娠与同种异体移植类似，在着床过程中， 若胚胎无法被母体保护且遭受异常的母体免疫系统攻击，则会引起胚胎种植失败或导致反复流产[7-9]。随着近年来相关研究的日益深入，免疫因素在复发性流产、不孕以及反复胚胎移植失败中起着至关重要的作用[10-11]。其中NK 细胞属于机体内固有免疫系统重要组成部分之一，在所有外周血淋巴细胞中占比5%～10%，且在子宫内膜淋巴细胞中占比高达70%～90%，参与了人类的妊娠全过程[12]。 外周血NK 细胞以CD56dimCD16+为主，具备一定的杀伤活性，属于人体抑制病毒入侵以及控制肿瘤扩散的重要防线。 而子宫NK 细胞可通过合成、分泌大量的细胞因子，继而对滋养层细胞的侵袭、修复以及胚胎血供改善、促进胎盘形成等起着调节作用[13]。故此，NK 细胞数量以及杀伤活性和妊娠结局的相关性研究已成为国内外关注的热点。

该研究结果显示，RRF 并发IT 患者外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性与妊娠结局均密切相关。 究其原因，NK 细胞数量以及杀伤活性的异常升高会导致过度血管新生以及炎症反应的发生， 进一步导致母体对胚胎产生较大的排斥作用，从而增加流产的风险[14]。此外， 经Spearman 相关性分析可得，RRF 并发IT 患者孕0 周、孕6 周的外周血NK 细胞百分数、外周血NK 细胞杀伤活性均和流产呈正相关关系 （r=0.523、0.611、0.509、0.587，P<0.05）。相关学者在研究中得出，RRF 并发IT 患者孕0 周、6 周的外周血NK 细胞百分数、外周血NK 细胞杀伤活性均和流产呈正相关关系（r=0.465、0.610、0.486、0.512，P<0.05）[15]， 与该文所得结论一致，提示外周血NK 细胞百分数≥12%可能预示孕妇的再次流产风险较高。

综上所述，RRF 并发IT 患者外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性与再次流产息息相关，且随着孕0周和孕6 周的外周血NK 细胞百分数及其杀伤活性增加，再次流产率升高。然而，该研究尚且存在一定的不足之处，如并未深入研究明确外周血细胞百分数以及杀伤活性正常范围，协助医生选择可能从相关治疗中获益的患者。